Характеристика на кандидата: Образец характеристика кандидата на должность — ЫАНИНО-1 — SNOW DIGITAL AGENCY — агентство полного цикла в сфере интернет-маркетинга

Содержание

Характеристики идеального кандидата — будущего сотрудника компании

Успешное прохождение собеседования — начало нового витка в профессиональной деятельности. В ходе интервью мы стараемся представить работодателю в выгодном свете свои профессиональные навыки. Однако не стоит забывать о том, что профессиональные характеристики находятся в симбиозе с личностными качествами. Какие из этих личностных характеристик являются наиболее важными для работодателей (вне зависимости от должности кандидата при приеме на работу)? Такой вопрос мы задали HR-менеджерам различных компаний Харькова.

Рвение к работе

Своеобразный «рейтинг» личностных характеристик, составленный на основе ответов, которые давали сотрудники кадровых служб харьковских компаний в интервью сайту «Работа в Харькове», возглавило желание работать и заинтересованность в работе, называемое нашими оппонентами «огоньком или искрой в глазах». Большинство работодателей при приеме соискателей на работу учитывает этот фактор как один из самых важных при наличии минимального уровня необходимых профессиональных навыков.

Стремление к развитию

Второе место в «хит-параде» личностных качеств занимает желание учиться и самосовершенствоваться. Как сказала Наталья Потапова, тренинг-координатор компании «Global Logic»: «Мы ищем людей, которые готовы обучаться. Это основной критерий, не зависящий от должности. Рынок динамично развивается и от специалистов любого профиля требуются все новые и новые навыки. Если человек стоит на месте и не развивается — это не наш сотрудник».

По словам Татьяны Ивановны Цыбульник, начальника отдела маркетинга девелоперской компании «Ипотечный дом», «…есть такое понятие как «чувство привыкания» — человек привыкает к определенной компании, его вроде бы устраивают условия и зарплата, и он не интересуется тем, как далеко шагнула его профессия, технологии. А на самом деле жизнь идет…

Применяя «бенч-маркетинг» (изучение и заимствование лучшего опыта в области маркетинга — Прим. ред.), предприятие рассматривает своих конкурентов, которые получают большую, чем они прибыль. Затем пытается определить, за счет чего они эту прибыль получают, и применить подобную стратегию или методы к себе. То же самое может применить к себе любой человек. Рынок сейчас меняется очень быстро. Если сегодня работник чего-то не успел: не прочитал, не повысил квалификацию — то он отстал уже не на год, а на пять».

Ответственность

Третье место среди наиболее важных личностных характеристик кандидатов и сотрудников, по мнению работодателей, занимает ответственность и добросовестность. Нет работодателей, которые хотели бы иметь в штате человека, готового так же легко дать свое обещание, как и забрать.

Наталья Потапова,«Global Logic»:

«Мы ценим ответственных людей. Большинство наших проектов — медицинские, они спасают жизни людей во всем мире. Если безответственно подходить к работе, будет страдать качество нашего продукта».

Умение работать в команде

Как считает Татьяна Гончарова, консультант по кадровым вопросам кадрового агентства «Акапи», «…сотрудника всегда нанимают для работы в определенной команде. Понятное дело, что есть риск того, что человек не приживется. Однако всегда хочется получить не временного сотрудника, а человека, который останется работать в компании до тех пор, пока не окупятся вложенные в него инвестиции».

Многие работодатели к важным личностным характеристикам отнесли также инициативность, дисциплинированность, опрятный внешний вид, уверенность в себе, умение ставить цель и правильно выбирать средства, организованность, креативность, индивидуальность, а также амбициозность, подкрепленную профессиональными навыками.

Сравнивая свои качества с приведенными нами характеристиками, нужно помнить, что идеального сотрудника нет и быть не может. Каждый человек — индивидуальность, обладающая определенным набором качеств, которые к тому же можно при желании менять и улучшать. В то же время, ориентировочный список требований, предъявляемых менеджерами по персоналу к потенциальным сотрудникам, может оказаться полезным при поиске работы.

© 2010 «Работа в Харькове»
При перепечатке материалов гиперссылка на сайт «Работа в Харькове» обязательна.

Характеристики кандидатов в депутаты Государственной думы от Кавказской группы. Письмо Лордкипанидзе и Чепелюгина в ЦК об избрании Комитета Владикавказской группы. Телеграмма Лордкипанидзе в Москву Корнилову о ходе выборов

— Любой -АбаканАбатскоеАвтополигонАганАгаповкаАгидельАгиришАзиатская, п.АккоАксаркаАкъярАлейскАлександров ГайАлтайскоеАлупкаАлябьевский (Ханты-Мансийский автономный округ — Югра)АнадырьАндреевка (Республика Башкортостан)Анжеро-Судженск (Кемеровская область)АнкараАнниноАпатитыАрадАрамильАрзамасАриэльАрлюк, п.ст.АрмавирАрмизонскоеАромашевоАрсеньевАрхангельскАсиноАскаровоАскиноАстраханьАфулаАчинскАшаАшдодАшкелонБ. СорокиноБаево, с.БайкаловоБаймакБака-аль-ГарбияБакалыБакуБалаковоБалашихаБанниковоБаня-ЛукаБаранчинскийБаргузинБарнаулБарселонаБарсовоБат-ЯмБатайскБейт-ШеанБейт-ШемешБейтар-ИлитБелгородБелградБелебейБелозерскоеБелоозерскийБелорецкБелоярскБелоярскийБелоярский, пгтБелый ЯрБердюжьеБерезово, пгт.БерезовскийБерезовский (Свердловская область)БеркутБерлинБеэр-ШеваБигилаБийскБикинБиробиджанБирскБишкекБлаговещенскБней-БракБобровоБогандинскийБогдановичБогородскоеБокситогорскБолгарБолчары, с.БольшевикБольшеустьикинскоеБольшое СорокиноБорБорисовка, с.БоркиБоровинкаБоровскийБоровскоеБородиноБратскБредыБрестБронницыБрянскБудапештБуланашБураевоБухарестВагайВалдайВаргашиВаршаваВаховскВашингтонВеликие ЛукиВеликий НовгородВенаВереяВерхнеказымский, п.ВерхнеуральскВерхнеяркеевоВерхние ТатышлыВерхний УфалейВерхняя Пышма (Свердловская область)ВерхотурьеВидноеВикуловоВинзилиВиноградовскийВифлеемВладивостокВладикавказВладимирВолгоградВолгодонскВолжскийВологдаВолховВолчанск (Свердловская область)ВольскВоронежВоскресенскВыборгВысоковскВьентьянГаджиевоГатчинаГвардейское, пгтГеоргиевскГерцлияГиват-ШмуэльГиватаимГлазовГолицыноГолышмановоГомельГорки-2Горно-АлтайскГорноправдинскГороденкаГоршковоГорьковкаГорюновоГрозныйГрэсГубкинскийГурзуфГурьевскДавлекановоДагомысДалматовоДачное (Республика Татарстан)ДегтярскДеденево, пос.Демьянка (Тюменская область)ДиксонДимонаДмитровДнепрДобринкаДолгодеревенскоеДолгопрудныйДомодедовоДрезденДроноваДубнаДубровкаДудинкаДушанбеЕгорьевскЕкатеринбургЕлабугаЕлатьмаЕлыкаево, с.ЕльцовкаЕманжелинскЕмбаевоЕрмолиноЕршовЕткульЖелезногорскЖуковскийЖуравлево (Кемеровская область)ЗаводоуковскЗавьяловоЗайцева речка, сп. (Ханты-Мансийский автономный округ — Югра)ЗалесовоЗаполярный (Мурманская область)ЗаречныйЗаринскЗвёздный городокЗеленоборскЗлатоустЗмеиногорскЗнаменскоеИвановкаИвановоИгаркаИглиноИгримИерусалимИжевскИзлучинскИкшаИланскийИнтаИрбитИркутскИсетскоеИскаИстраИсянгуловоИсянгуловоИшимИшимбайЙехуд-МоноссонЙокнеамЙошкар-ОлаКабанскКазанскоеКазаньКазымКалансуаКалач-на-ДонуКалининградКалтанКалтасыКалугаКамаКаменск-УральскийКаменск-ШахтинскийКамень-на-ОбиКамышинКанашево, с.КанскКарабашКарагандаКарасукКаркатеевыКармаскалыКармиэльКарпинскКарталыКасимовКаскараКаслиКатав-ИвановскКафр-КасемКашиноКемеровоКерчьКетовоКиевКижингаКизильскоеКиргиз-МиякиКириши (Ленинградская область)КировКировскКирьят-АтаКирьят-БяликКирьят-ГатКирьят-МалахиКирьят-МоцкинКирьят-ОноКирьят-ШмонаКирьят-ЯмКиселевск (Кемеровская область)КичигиноКишинёвКлепиково, с.КлинКогалымКолесниковоКоломнаКолпашевоКоммунистическийКомратКомсомольск-на-АмуреКомсомольскийКондинскоеКонстантиново (Рязанская область)КопейскКоркиноКоролёвКорсаковКоряжмаКостанайКостромаКотельникиКотовскКрасная ГоркаКрасноармейскКрасногорскКраснодарКраснознаменскКраснообскКрасносельское (Челябинская область)КраснотурьинскКрасноуральскКрасноярскКриулино (Свердловская область)КронштадтКуала-ЛумпурКузнецкКуйбышевскКулундаКумертауКуминскийКунашакКурганКурсавкаКурскКуртамышКурчатовКусаКушваКфар-СаваКызылКыштымКяхтаЛабытнангиЛангепасЛарёвоЛебедевкаЛебяжьеЛевашовоЛенино, пгтЛенинск-КузнецкийЛермонтово, с.Лесниково, с.Леуши, п.ЛипецкЛобняЛодЛодейное ПолеЛомоносовЛондонЛосино-ПетровскийЛотошиноЛугаЛуговойЛуговскойЛунино, р.п.ЛуховицыЛыткариноЛыхма (Ханты-Мансийский автономный округ — Югра)ЛюбаньЛюблянаЛянторЛяховоМаале-АдумимМаалот-ТаршихаМагаданМагасМагнитогорскМадридМайкопМалеевка (Московская область)Малиновка, п.Малиновский (Ханты-Мансийский автономный округ — Югра)МалоязМалый Атлым, с.МалышеваМаранка, с.МарфиноМаслянскийМахачкалаМашковоМегионМедыньМеждуреченскМеждуреченскийМелеузМесягутовоМиассМиасскоеМигдаль-ха-ЭмекМизоновоМинскМинусинскМихайловкаМичуринскМодиин-ИлитМодиин-Маккабим-РеутМожайскМолодежный (Московская область)МолочныйМончегорскМорткаМоскваМосковскийМосрентгенМошковоМраковоМужиМундыбаш, пгт.МуравленкоМуриковоМурманскМытищиМюнхенНабережные ЧелныНавашиноНагарияНадымНазаретНальчикНаро-ФоминскНаровчатка, п.Нарьян-МарНацрат-ИллитНекрасовскийНелидовоНемчиновкаНесвижНетанияНетивотНефтекамскНефтеюганскНешерНижневартовскНижний НовгородНижний ТагилНижняя СалдаНижняя ТавдаНикель (Мурманская область)Николаевка, д.Николо-БерезовкаНикольскНовая заимкаНовичиха (Алтайский край)НовоаганскНовоалександровкаНовоалтайскНовоаннинскийНовобелокатайНовоегорьевскоеНовоивановскоеНовокузнецкНоволыбаевоНоворомановоНовоселезневоНовосибирскНовосиньково (Московская область)НовотарманскийНовоуральскНовочеркасскНовый ПутьНовый УренгойНогинскНоябрьскНур-СултанНяганьНязепетровскОбнинскОзерскОзёрыОктябрьскийОктябрьское, Ханты-Мансийский автономный округОктябрьское, Челябинская областьОкуловкаОкунёвоОленегорскОльховкаОмскОмутинскоеОнохиноОпочкаОр-АкиваОр-ЙехудаОрджоникидзевскоеОрелОренбургОрехово-ЗуевоОрловкаОсинникиОстровОфакимОхаОхтеурье, сп.ОчёрПавловскПадунПекинПензаПервоуральскПересветПермьПершиноПетергофПетровское (Московская область)ПетрозаводскПетропавловкаПетропавлоск-КамчатскийПечорыПионерскийПластПлатоновкаПлесПлотниково (Кемеровская область)ПодольскПодосинки, пос.ПойковскийПокачиПоловинкаПолярныйПорховПоселки, с.посёлок Совхоза Будённовец (Дмитровский городской округ, Московская область)ПочинокПрагаПреображенскаяПрииртышскийПриобье, гп.ПриозерскПриполярный (Ханты-Мансийский автономный округ — Югра)ПротвиноПрохоровкаПсковПуровскПуршевоПушкинПушкиноПущиноПыть-ЯхПышма, пгтПятковоРаананаРадужныйРаевскийРамат-ГанРамат-ха-ШаронРаменскоеРамлаРассветРахатРебриха, с.РевдаРегенсбургРежРеутовРеховотРимРишон-ле-ЦионРовноРогачевоРостов-на-ДонуРош-ха-АинРошальРощинскийРубцовскРузаРузаевкаРусскийРыбинскРыбное, пос.РязаньСакиСалаватСалехардСалымСамараСанкт-ПетербургСаранскСаратовСаткаСахнинСаянскСвободный, п.СдеротСевастопольСеверо-Енисейский (Красноярский край)СеверобайкальскСеверодвинскСевероморскСевероуральскСеверск (Томская область)СелятиноСергиев ПосадСергиноСеребряные ПрудыСередаСеровСерпуховСестрорецкСетовоСеулСибайСибирскийСимферопольСингапай, сп.Синий БорСитне-ЩелкановоСкалистый (Челябинская область)СкопинСлавгородСладковоСланцыСмирных (Сахалинская область)СмоленскСнежинскСнежногорскСоветская ГаваньСоветскийСолнечногорскСолнечныйСолонешноеСорумСосновкаСофияСочиСпас-ЗаулокСредняя АхтубаСтавропольСтарая ЗаимкаСтарая ЛадогаСтароалейскоеСтаробалтачевоСтарокуктовоСтерлитамакСтрежевойСтрехниноСтуденческий, п.СтупиноСузунСургутСухой ЛогСызраньСыктывкарСысертьТабуныТаганрогТаежный (Ханты-Мансийский автономный округ — Югра)ТазовскийТайбеТайгаТалдомТалинка (Ханты-Мансийский автономный округ — Югра)ТалицаТамбовТамраТарасковоТарко-СалеТашкентТверияТверьТель-АвивТимоново (поселок)ТираТираспольТират-КармельТихвинТоболовоТобольскТолбазыТомскТопкиТосноТрёхгорныйТроицкТроицкий (Белгородская область)Троицкое, с.ТуапсеТуймазыТулаТуринск (Свердловская область)ТуртасТюменьУватУвельскийУгловское, с.УдимскийУйскоеУлан-БаторУлан-УдэУльт-ЯгунУльяновскУмм-эль-ФахмУнъюганУпоровоУрайУральскУренгойУрюпинскУсовоУспенкаУсть-КалманкаУсть-КатавУсть-КачкаУсть-Кокса, с.Усть-Кяхта, с.УфаУчалыУчкекенУшья, д.Уяр (Красноярский край)Федино (Московская область)ФедоровкаФедурновоФеодосияФершампенуаз, с.ФроловоХабаровскХабарыХадераХайфаХанойХанты-МансийскХанымейХарсаим, с.ХельсинкиХимкиХод-ха-ШаронХолонХомутининоХотьковоЦелина, п.ЦелинныйЦфатЧайковскогоЧандигархЧаныЧастоозерье (Курганская область)ЧебаркульЧебоксарыЧекмагушЧелябинскЧервишевоЧеремшанка, с.ЧереповецЧеркесскЧерноголовкаЧерноморскоеЧерняховск (Калининградская область)ЧесмаЧеховЧистопольЧитаЧишмыШадринскШаляШамары, п. Шаран (Республика Башкортостан)ШатураШаховскаяШацкШевляковоШефарамШипицино, пгтШугур, д.ШумихаШурупинскоеШушарыЩёлковоЩучьеЭйлатЭлектростальЭлистаЭльадЮганская Обь, сп.ЮгорскЮграЮжно-СахалинскЮжноуральскЮргинский, п.ЮргинскоеЯвнеЯгодный, п.ЯзыковоЯкутскЯлтаЯлуторовскЯнаулЯрЯр-СалеЯренск, с.ЯрковоЯрославльЯхромаЯя

Педагогическая характеристика кандидата образец Характеристики и рекомендации Образцы и шаблоны документов

Интеллектуальное рейдерство — новый виток борьбы за власть — (…) Он что. Вся новость

Получение пособий на ребенка в РФ гражданам УкраиныЗдравствуйте. Я гражданка Украины. Меня интересует вопрос такой. В. Вся новость

Получение разрешения на временное проживание в РФ гражданке УкраиныЯ приехала 1 месяц. Вся новость

Характеристика образец на кандидата

В советские времена рекомендацию гаранта заменяла составленная характеристика. Сегодня характеристики снова начали величать письмами-рекомендациями. Если приходил период поступать на работу, или занять важную должность. Одно дело получать характеристики, другое составлять. В современных реалиях в наш обиход вошло капиталистическое понятие как рекомендательное письмо. Почти всем приходилось связываться с понятием как характеристика. Как правило была необходима характеристика. Вот пример, который оставит время изготовления правильного документа.

Бланк оценки кандидата

Как только за кандидатом захлопнется дверь, не откладывая в «долгий ящик», пока свежие впечатления не испарились, оцените его. После того как нижеприведенный бланк будет заполнен (а предварительно распечатан по образцу), положите его в личное дело кандидата.

Эта форма оценки кандидата будет удобна, если вы придерживались рекомендованной схемы проведения интервью. Она позволит сопоставить требуемые вакансией качества, навыки и возможности кандидата с его объективными качествами, навыками и возможностями, то есть сравнить желаемое и действительное.

БЛАНК ОЦЕНКИ КАНДИДАТА

Ф.И.О. кандидата: _______________________________________________________________

Должность: _____________________________________________________________________

Дата интервью: «_________»____________200__ года

Установленное время начала интервью _____________________________________________

Фактическое время прихода кандидата (при опоздании указать причину опоздания)______________________________________________________________________

№ ______________________________________________________________________

Характеристика «Идеальный» кандидат (в эту графу заранее вписывают желаемые качества после экспертизы вакансии) __________________________________________________________

Соответствующие данные кандидата (в эту графу вписывают фактические качества кандидата) __ _____________________________________________________________________________ _

Оценка

Пол _____________________________________________________________________________
Возраст __________________________________________ ____________________________
Семейное положение ___________________________________________________________
Названия учебных заведений, где кандидат мог бы получить необходимые для успешного выполнения своих функциональных обязанностей знания. Его желательнаяспециализация и дополнительное образование ______________________________________________________________________________
Названия возможных занимаемых кандидатом должностей._______
Профиль и названия компаний, где кандидат мог бы получить и освоить необходимые для вакансии навыки.
Минимальный опыт работы.
Список, должностных обязанностей, которые кандидат должен был выполнять.
Степень владения оргтехникой (ПК, ксерокс, факс, др.), знание программных продуктов.
Степень владения иностранным языком_______________
Профессиональные знания и навыки, необходимые кандидату.
Наличие автомобиля, водительских прав с указанием категории, стажа вождения.
Наличие жилья, желательное место проживания.
Психологические качества, которые помогут успешно справляться с должностными обязанностями и освоить новые навыки .
Психологические качества, несовместимые с работой на данной должности
Психологические характеристики. позволяющие достичь совместимости с сотрудниками, непосредственно связанными с будущим работником и соответствующие корпоративной культуре организации.
Психологические качества, несовместимые с работой в данной компании
Дополнительные требования.

Краткая информация и мнение должностного лица, проводившего первичное интервью (т.е. ваша неформальная оценка кандидата) тоже очень важна. Ниже приведена форма, по которой вы сможете оценить соискателя.

Для заполнения этой формы обведите подходящую (вашему, по возможности объективному, мнению о кандидате) цифру в каждой строчке. Посчитайте общую оценку, максимальный балл равен 60 минимальный — 12. Оптимальный балл получится, если кандидат набрал не больше трех троек при условии, что остальные отметки 4 и 5.

При оценке не путайте внешний вид со стоимостью одежды и личным вкусом кандидата, в графе внешний вид имеется в виду аккуратность прически, адекватный макияж и маникюр (если перед вами женщина), чистая, опрятная, подходящая случаю одежда, ненавязчивость аксессуаров. Кроме тембра голоса, нужно обращать внимание на темп речи, возможные дефекты звукопроизношения, словарный запас, использование жаргонных слов.

В графе физического состояния особо внимательно оценивайте женщин и пожилых людей. Также следует отличать качества, необходимые при поступлении на работу, от тех, которые могут быть достаточно быстро приобретены в процессе адаптации на рабочем месте (критичность условий).

ВНЕШНИЙ ВИД

Неопрятный
Небрежность в одежде
Опрятный

Уделяет особое внимание своему внешнему виду

Безупречный

ГОЛОС

Резкий, раздражающий
Невнятный
Приятный
Ясный, понятный

Экспрессивный, энергичный

ФИЗИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ

Неприятная, нездоровая внешность
Неэнергичный, апатичный
Хорошая физическая форма, приятная внешность
Бодрый, энергичный

Очень энергичный, в отличной форме

Необычайно выдержанный

УВЕРЕННОСТЬ

Застенчивый
Заносчивый
Последовательный, доказательный
Достаточно самоуверенный

Прямолинейный

Демонстрирует уверенность

Необычайно самоуверенный

ХОД МЫСЛЕЙ

Нелогичный
Неопределенный
Неясный
Распыляется по пустякам

Ясно выражается, слова адекватны значениям

Убедительный

Логичный

Необычайная способность в логике мысли

ГИБКОСТЬ УМА

Тугодум, медленно соображает
Равнодушно воспринимает сказанное
Внимателен, четко выражает свои мысли
Сообразителен, задает адекватные вопросы

Необычная острота ума, воспринимает комплекс идей

МОТИВАЦИИ И АМБИЦИИ

Вял, не амбициозен
Отсутствие интереса к саморазвитию
Демонстрирует стремление к саморазвитию
Определяет будущие цели, хочет добиться успеха

Высокие амбиции, саморазвитие

ОПЫТ РАБОТЫ, ОБРАЗОВАНИЕ

Не соответствуют должности
Не соответствуют, но полезны
Соответствуют

Выше требуемого

Особо подходящие

Продолжает учиться, повышать уровень

ЛИЧНОСТЬ КАНДИДАТА

Незрелый, импульсивный
Упрямый
Разумный, зрелый
Кооперативный
Ответственный

Зрелый, самодостаточный

ОТНОШЕНИЕ К ПРЕЖНЕМУ МЕСТУ РАБОТЫ

Ярко негативное
Демонстрирует недовольство
Уклоняется от прямых вопросов
Выражает позитивное отношение

Демонстрирует позитив, объективно оценивает «+» и «-»

ПОВЕДЕНИЕ В ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ОБСТОЯТЕЛЬСТВАХ

Выражает крайнюю степень смущения или агрессии
Заметно нервничает
Не выражает дискомфорта, не стремится продолжать беседу

Демонстрирует спокойное поведение, продолжает диалог

Реагирует адекватно, ищет способы продолжения беседы

Принятое решение: «Принять» ( ), «Отказать» ( )

Личностная характеристика кандидата при собеседовании

Определения личностных характеристик кандидата на вакантную должность являются одной из главных задач интервьюера. И одной из сложных, так свои преимущества соискатели пытаются преувеличить, а недостатки скрыть.

Порой очень сложно провести анализ и сделать выбор кандидата на рассматриваемую должность. Поэтому, при проведении собеседования необходимо задать вопросы, ответы на которые помогут нам точно и правильно оценить личностные качества кандидата.

Наиболее важные характеристики человека для трудовой деятельности — это ответственность, целеустремлённость, предприимчивость, самостоятельность, стрессоустойчивость, лидерство, планирование, организаторские способности. Приведём к каждой характеристике ряд вопросов, которые помогут её выявить и оценить.

Для того чтобы определить, насколько кандидат ответственен, задайте такие вопросы:

можете ли вы брать на себя ответственность за неудачи и поражения?

как вы относитесь к помощи?

когда в последний раз вы кому-то помогли? В чём?

как результат вашей предыдущей работы влиял на компанию, её сотрудников?

Целеустремлённость можно оценить, задав следующие вопросы:

можете ли вы преодолевать трудности?

как вы поступаете при появлении препятствий: продолжаете действовать, добиваться результата, или предпочитаете отступить?

можете ли вы перенести большое количество неудач?

какие ваши последние достижения?

будете ли вы действовать при неблагоприятных факторах?

с какими трудностями вы сталкивались на предыдущей работе? Как вы их решали?

Как вы устроились на первую работу?

Самостоятельность можно оценить по таким вопросам:

когда вы заработали первые деньги?

куда вы потратили первые заработанные деньги?

когда вы стали жить отдельно от родителей?

когда вы начали жить за свои средства?

Насколько претендент стрессоустойчивый, помогут определить такие вопросы:

можете ли вы принимать адекватные решения при нехватке времени, неопределённости, давлении?

Коммуникативные характеристики оцениваются с помощью следующих вопросов:

общаетесь ли вы с бывшими коллегами?

какие личностные качества вы цените в людях?

как часто вы становитесь участником конфликта?

Задав следующие вопросы, вы выявите организаторские способности кандидата:

как вы распределяете обязанности среди работников?

Как вы контролируете своих работников?

по каким вопросам к вам чаще всего обращаются подчинённые?

за что вы штрафуете, а за что выдаёте премии?

Для определения способности стратегического и тактического планирования следует получить ответы на такие вопросы:

можете ли вы одновременно заниматься несколькими делами?

сколько способов решения вопроса вы обычно имеете?

как вы планируете свой день? Трудовое время?

опишите, что вы запланировали год назад? Что удалось, а что не удалось достигнуть?

знаете ли вы о тайм-менеджменте?

Определить, насколько претендент обладает качествами лидера, помогут такие вопросы:

были ли вы старостой класса, группы, капитаном команды?

замечали ли вы за собой способности влиять на других людей?

характеристика на кандидата

Характеристика на кандидатов из числа граждан, прошедших и не проходивших военную службу для поступления на учебу в военно-учебное заведение

Характеристика на кандидатов из числа военнослужащих (за исключением офицеров) для поступления на учебу в военно-учебное заведение

Характеристика на кандидата из числа граждан, прошедших и не проходивших военную службу для поступления на учебу в соответствующее военно-учебное заведение

Характеристика на кандидата из числа военнослужащих (за исключением офицеров) для поступления на учебу в соответствующее военно-учебное заведение

Характеристика на кандидата для поступления в учебный военный центр (образец)

Образец характеристики на кандидата поступающего в военно учебное заведение

Автор: qrwa от 04.06.2013, посмотрело: 5695

Приказ Министра обороны РФ от 24. Характеристика (для гражданской молодежи) кандидатов на учебу в военно- учебные заведения Министерства обороны СССР. Экзаменационная ведомость поступающих в военно-учебное заведение. Возраст лиц, поступающих на учёбу, определяется по состоянию на 1 августа года поступления. Образец характеристики после окончания высшего учебного заведения. Образец характеристики на кандидатов из числа военнослужащих. Характеристика на кандидата поступающего в военно учебное заведение. Правила написания характеристики — образец характеристики.

военные училища

Василий Максимов 29 октября 2007 года

ПРАВИЛА ПРИЕМА В НАХИМОВСКОЕ ВОЕННО-МОРСКОЕ УЧИЛИЩЕ

В Нахимовское военно-морское училище принимаются юноши, граждане Российской Федерации, в возрасте 14-15 лет, успешно окончившие в год поступления в училище 8 классов средней школы Российской Федерации и годные по состоянию здоровья к обучению в училище и службе в Военно-Морском Флоте.

ОБЯЗАТЕЛЬНЫМ условием для поступления в Нахимовское военно-морское училище является изучение в школе АНГЛИЙСКОГО ЯЗЫКА. Изучающие другие иностранные языки в училище НЕ ПРИНИМАЮТСЯ.

Заявление (рапорт) о приеме учащихся в Нахимовское военно-морское училище подается родителями или лицами их заменяющими до 1 июня:

— гражданами Российской Федерации, проживающими на ее территории, на имя районного (городского) военного комиссара по месту жительства

— гражданами Российской Федерации, проходящими военную службу или работающими за пределами Российской Федерации, соответственно на имя командира воинской части Российской Федерации или руководителя предприятия, организации, учреждения Российской Федерации.

В заявлении (рапорте) оговаривается согласие родителей (лиц, их заменяющих) кандидатов на направление их после окончания училища для дальнейшего обучения в военное образователь-ное учреждение Министерства обороны.

К заявлению (рапорту) прилагаются следующие документы:

1. Личное заявление кандидата на имя начальника училища о желании учиться в данном училище

2. Заверенная копия свидетельства о рождении

3. Автобиография

4. Копия документа установленного образца, подтверждающего Российское гражданство кандидата и его родителей, для проживающих за пределами Российской Федерации

5. Выписка из табеля успеваемости кандидата с оценками за 1-3 учебные четверти 8 класса с указанием изучаемого иностранного языка, заверенная гербовой печатью школы

6. Педагогическая характеристика кандидата за подписями классного руководителя и директора школы, заверенная гербовой печатью школы

7. Четыре фотокарточки размером 3 х 4 см (без головного убора, с местом для оттиска печати в правом нижнем углу)

8. Копия медицинского страхового полиса

9. Карта медицинского освидетельствования кандидата к поступлению в училище, выданная военно-врачебной комиссией при военном комиссариате или гарнизонной военно-врачебной комиссией (вкладывается в личное дело кандидата)

10. Справка с места жительства родителей (лиц, их заменяющих) с указанием состава семьи и жи-лищных условий

11. Копии документов, подтверждающих право кандидата на льготы при поступлении в училище:

а) от детей-сирот и лиц, оставшихся без попечения родителей, кроме того, представляются:

— заверенные свидетельства о смерти отца и матери

— копия решения суда или органов местного самоуправления об установлении опеки (попечительства)

— документы от органа местного самоуправления, подтверждающие наличие жилой площади

— заверенная копия удостоверения опекуна (попечителя)

б) от остальных категорий, пользующихся правом внеконкурсного зачисления, кроме того, представляются:

— справка или выписка из личного дела военнослужащего, погибшего при исполнении обязанностей военной службы или умершего вследствие увечья либо заболевания, полученных им при исполнении обязанностей военной службы, об исключении из списков воинской части, копии свидетельства о смерти, заверенные в установленном порядке

— справка воинской части о прохождении военной службы по контракту в зоне военного конфликта в настоящее время, заверенная гербовой печатью

— копия свидетельства о расторжении брака, выписка из домовой книги и финансово-лицевого счета (для детей военнослужащих, воспитывающихся без матери (отца)

— справка из воинской части о выслуге лет в календарном исчислении (20 лет и более) военнослужащего, заверенная гербовой печатью или заверенная копия удостоверения «Ветеран военной службы»

— выписка из приказа об увольнении с военной службы по достижении предельного возраста пребывания на военной службе, состоянию здоровья или в связи с организационно-штатными мероприятиями, если общая продолжительность военной службы составляет в календарном исчислении 20 лет и более, заверенная гербовой печатью.

Подлинное свидетельство о рождении (паспорт), табель успеваемости по итогам учебного года за 8 класс, похвальный лист «За отличные успехи в учении», медицинский страховой полис и подлинные документы, подтверждающие право кандидата на льготы при поступлении, предъявляются кандидатом в приемную комиссию училища по приезду.

Допущенные к экзаменам кандидаты прибывают в училище по вызову, в котором будет указан день и час явки. Вызов в училище дает право на получение проездных документов в военных комиссариатах по месту жительства.

Кандидаты, прибывшие в училище, проходят поверку состояния физической подготовленности, профессионально-психологический отбор, медицинское освидетельствование и сдают конкурсные вступительные экзамены.

Экзамены проводятся в объеме программы 8-летней школы Российской Федерации: по русскому языку -диктант по математике — письменно. Опоздание на экзамены НЕ ДОПУСКАЕТСЯ.

Кандидаты, не удовлетворяющие условиям приема по состоянию здоровья, физической подготовленности, профессионального психологического отбора или не выдержавшие вступительные экзамены, а также не прошедшие по конкурсу, в училище не принимаются и направляются к месту жительства родителей (законных представителей). Для проезда они обеспечиваются проездными документами.

Кандидаты, прибывшие в Нахимовское училище для сдачи вступительных экзаменов, обеспечиваются питанием по нормам довольствия нахимовцев и общежитием со дня, указанного в вызове. Лицам, сопровождающих кандидатов жильем и питанием НЕ ОБЕСПЕЧИВАЮТСЯ.

Срок обучения в Нахимовском училище 3 года. По окончании училища нахимовцы-выпускники распределяются и направляются в военные образовательные учреждения с учетом потребности в военных кадрах, желаний выпускников, их деловых качеств, уровня общеобразовательной, военной и физической подготовки, состояния здоровья и дисциплинированности.

НОРМАТИВЫ ПО ФИЗИЧЕСКОЙ ПОДГОТОВКЕ ДЛЯ КАНДИДАТОВ, ПОСТУПАЮЩИХ В НАХИМОВСКОЕ ВОЕННО-МОРСКОЕ УЧИЛИЩЕ

Подтягивание на перекладине:

ОЦЕНКА 5 — 10 раз

ОЦЕНКА 4 — 8 раз

ОЦЕНКА 3 — 7 раз

Бег 60 метров:

ОЦЕНКА 5 — 8,4 сек.

ОЦЕНКА 4 — 9,2 сек.

ОЦЕНКА 3 — 10,0 сек.

Кросс 2000 метров:

ОЦЕНКА 5 — 9,0 мин.

ОЦЕНКА 4 — 9,30 мин.

ОЦЕНКА 3 — 10.0 мин.

— Указаны нормативы для кандидатов, окончивших 8 классов.

Основание:

1. Наставление по физической подготовке и спорту для суворовских военных и Нахимовского во-енно-морского училищ.

2. Образовательная программа «Физическая культура», рекомендованная Министерством образо-вания Российской Федерации.

1. Флюорографическое исследование органов грудной клетки в двух проекциях.

2. Рентгенография около носовых пазух.

3. ЭКГ в покое и после нагрузки.

4. Общий анализ крови.

5. Исследование крови на ВИЧ и серологические реакции на сифилис.

6. Общий анализ мочи.

7. Исследование кала на яйца гельминтов и дизентерийную группу.

8. Посев и зева и носа на дифтерию.

9. Справка о состоянии на учете из психоневрологического диспансера.

10. Справка о состоянии на учете из наркологического диспансера

11. Справка о состоянии на учете из противотуберкулезного диспансера.

12. Справка о состоянии на учете из кожно-венерологического диспансера

13. Сведения о состоянии его на диспансерном учете по поводу хронических заболеваний и пере-несенных в течение последних 12 месяцев инфекционных и паразитарных болезнях.

14. При прибытии в училище необходимо представить результаты анализов крови и мочи, сданных не более чем за 10 дней до срока, указанного в вызове.

Примечание: юноши, окончившие 9,10 классов, а также учащиеся ПТУ и техникумов в училище не принимаются.

АДРЕС УЧИЛИЩА: 197046, Санкт-Петербург, Петроградская набережная дом 2/4, Нахимовское военно-морское училище, Отдел кадров (по приему).

Основание: Приложение N 2 к приказу МО РФ от 15.01.2001 г. N 25.

================================================

Вот почитайте:

http://www.ruscadet.ru/kktoday/kk%20mo/sms_nmns/nvmu.htm

Источники:
pozovsud.com.ua, bizataka.ru, hr-portal.ru, reklama.allelets.ru, www.askguru.ru

Следующие бланки:

21 ноября 2021 года

Характеристика кандидата в депутаты

В каких случаях необходима характеристика

Просьба подготовить характеристику на работника чаще всего адресуется специалистам отдела кадров:

самим сотрудником;
государственными органами;
руководителем организации.

В первом и втором случаях готовая характеристика с места работы нужна для предъявления ее в какие-то инстанции за пределами той организации, в которой сотрудник работает (например, в органы опеки и попечительства; или в учебное заведение, в котором он обучается без отрыва от производства; или по новому месту работы; или в суд). Таким образом, характеристика требуется внешнему заказчику.

В третьем случае готовятся некие внутриорганизационные процедуры, связанные с оценкой сотрудника, и документ будет использован внутри учреждения. Его заказчик внутренний.

Специалисты кадровой службы не обязаны писать характеристику самостоятельно, ведь они не могут знать деловые качества каждого работника, но они должны организовать подготовку такого документа: обратиться к непосредственному начальнику, оказать ему помощь в написании и оформлении документа.

От целей создания характеристики будет зависеть содержание. Поэтому рассмотрим различные варианты, часто встречающиеся на практике.

Пример характеристики для награждения работника

Для начала приведем пример положительной характеристики с места работы. Это наиболее частый вариант, в котором перечисляются сильные стороны человека и его положительные профессиональные качества.

Характеристика

Черепова Константина Анатольевича, 23 марта 1962 года рождения, образование высшее,

главного энергетика ЗАО «Новосибирский машиностроительный завод»

Черепов Константин Анатольевич начал трудовую деятельность на Новосибирском металлургическом заводе в 1984 году после окончания Новосибирского технического университета по специальности «электроснабжение», факультет промышленной энергетики, прошел путь от инженера энергобюро завода до начальника группы электротехнического измерения.

За период трудовой деятельности на предприятии Черепов Константин Анатольевич зарекомендовал себя квалифицированным специалистом, высоким профессионалом, инициативным и обладающим высокими организаторскими способностями руководителем.

Черепов Константин Анатольевич является инициатором разработки и внедрения на предприятии ряда технических инноваций в вверенной сфере деятельности, в том числе по введению альтернативных источников энергетики в промышленности. Это позволило снизить себестоимость производимой продукции, что позволило предприятию конкурировать с зарубежными поставщиками, участвовать в государственных и муниципальных закупках.

За годы трудовой деятельности неоднократно направлялся на курсы повышения квалификации по специальности «электроснабжение», стремится к самостоятельному повышению своего профессионального и управленческого уровень. В период работы на предприятии получил второе высшее образование по специальности «Управление персоналом».

За время работы Черепов Константин Анатольевич неоднократно поощрялся ведомственными и муниципальными грамотами, в том числе награжден Почетной грамотой Департамента экономического развития города Новосибирска, благодарностями генерального директора ЗАО «Новосибирский машиностроительный завод».

Генеральный директор ЗАО «Новосибирский машиностроительный завод»

Одинцов П.К.

30 апреля 2017 года

Статус депутата местного совета депутатов

Депутатом местного Совета депутатов (далее — депутат Совета) является свободно избранный гражданами, проживающими на территории, входящей в избирательный округ, представитель, уполномоченный участвовать в осуществлении государственной власти местным Советом депутатов (далее — Совет), представлять своих избирателей в государственных органах и других организациях, осуществлять иные полномочия, предусмотренные Конституцией Республики Беларусь, Законом Республики Беларусь «О статусе депутата местного Совета депутатов» от 27.03.

Это весьма привлекательный образ, однако реальным людям очень трудно ему соответствовать.

Авторитет кандидата может подкрепить его должностной статус и имидж той организации, с которой он в профессиональном плане связан. Следует учитывать, что профессиональный опыт не обязательно должен быть связан с опытом государственного управления. Он может быть любым, но самое главное чтобы он был успешным.

Подтвердить право на лидерство могут и яркие факты жизненного пути, подтверждающие смелость и решительность политика, например, служба в армии, участие в военных действиях, борьба с коррупцией и привилегиями, с проявлениями несправедливости. Биография, будучи первоначальной визитной карточкой кандидата не должна быть составлена сухим, официальным языком, должна быть тщательно отретуширована и не содержать ничего такого что могло бы произвести неблагоприятное впечатление на избирателей.

Новое законодательство предусматривает возможность создания в Советах депутатских групп, которые могут рассматриваться в качестве первых попыток перехода в будущем к фракционной работе местных представительных органов. Можно предположить, что местная демократия и самоуправление приобретут реальные черты народовластия параллельно со становлением многопартийной системы.

Президиум местного Совета депутатов. В соответствии с Законом «О местном управлении и самоуправлении в Республике Беларусь» (ст. 19) в областных (Минском городском), районном, городском (города областного подчинения) Советах для организации их работы создаются президиумы. В других Советах эти функции выполняет председатель. В состав президиума Совета входят: — председатель Совета; — заместитель (заместители) председателя; — председатели постоянных комиссий Совета.

Что такое характеристика для награждения работника

Содержание данного типа документа работодатель не обязан согласовывать с сотрудником, за исключением случая проведения аттестации, когда он должен ознакомить с ней аттестуемого заранее. Если тот выражает недовольство ею, а также результатами аттестации, он может обратиться в апелляционную комиссию или суд.

Одинцов П.К.

30 апреля 2017 года

Сразу оговоримся, что рассматриваемый документ не является представлением к награде. То есть характеристика лишь сопровождает письменную позицию руководства о необходимости поощрения работника за профессиональный вклад в развитие своего дела. Поэтому включать в характеристику формулировки – достоин к награждению или т.п. – бессмысленно.

Характеристика для награждения работника – это документ оценочный. В нем описываются профессиональные достижения, трудовая деятельность, деловые и личные качества. Для руководителей в документе важно отразить наличие сплоченного и стабильного коллектива, управленческие и организаторские способности.

Несмотря на оценочный характер, характеристика для награждения работника – документ официальный. В ней должны быть отражены заслуги работника перед предприятием, организацией, которые являются основанием для поощрения. Оформляется документ в письменной форме официально-деловым стилем (должны отсутствовать неточности, двусмысленность, исправления, речевые повторы и и.п.).

Для удобства в применении мы предлагаем следующий алгоритм заполнения характеристики для награждения:

Наименование «характеристика», Ф.И.О., год рождения, образование, должность
Сведения об общей трудовой деятельности, стаж работы на предприятии, «движение» по службе
Оценка деловых и личных качеств, вклад в деятельность предприятия и отдела, конкретные заслуги, результаты (примеры), конкретные количественные показатели работы
Взаимоотношения в коллективе и руководстве
Сведения о имеющихся наградах, поощрениях

Подписан документ должен быть руководителем предприятия. Если награда предполагает локальный характер, то непосредственным руководителем. Характеристика для награждения работника должна быть заверена печатью организации.

Форма характеристики на кандидата, поступающего в военно-учебное заведение: бланк, образец 2021

Приложение N 5 к Инструкции (п. 67) об условиях и порядке приема в военные образовательные учреждения высшего профессионального образования Министерства обороны Российской Федерации

Форма

                              ХАРАКТЕРИСТИКА
на кандидата, поступающего в военно-учебное заведение

Я, ____________________________________________________________________
(фамилия, имя, отчество, число, месяц и год рождения, уровень
образования, место работы, занимаемая должность, почтовый адрес
предприятия, учреждения, воинской части, контактный телефон
руководителя)
лично знаю ____________________________________ с _________________________
(фамилия, имя, отчество кандидата)       (указывается год)

Основное содержание характеристики:

1. Общие данные на кандидата:
фамилия,  имя,  отчество,  число,  месяц, год и место рождения, уровень
образования  (с указанием учебных заведений, которые окончил), место работы
(учебы,    службы),    занимаемая    должность,   специальность   (воинская
специальность), квалификация и стаж работы по специальности.
2. Общественная активность и основные моральные качества:
представление о социальной значимости военной службы и уровень развития
чувства ответственности за защиту Отечества;
участие  в  общественной  жизни учебного (производственного, воинского)
коллектива, организаторские способности и особенности в общении;
уровень  развития  основных морально-волевых качеств (принципиальность,
смелость,    решительность,    мужество,    выдержка    и    самообладание,
дисциплинированность,      исполнительность,     трудолюбие,     честность,
целеустремленность, настойчивость, самостоятельность и др.).
3. Военно-профессиональная направленность:
искренность и обоснованность стремления стать офицером;
основные интересы и увлечения;
склонность    к    военно-профессиональной   деятельности,   стремление
приобрести и совершенствовать знания, навыки и умения, связанные с ней;
спортивные достижения;
качество   усвоения  программы  боевой  подготовки,  степень  овладения
вооружением  и боевой техникой, выполнение боевых нормативов, бдительность,
умение  хранить  военную  и  государственную тайну (для кандидатов из числа
военнослужащих).
4.  Другие  наиболее характерные положительные и отрицательные свойства
личности  и вывод о целесообразности направления для поступления на учебу в
военно-учебное заведение.

Руководитель образовательного учреждения (для обучающихся)

Руководитель организации (для трудящихся)

Командир воинской части (для военнослужащих)
___________________________________________________________________________
(подпись, инициал имени, фамилия)

"__" ______________ 20__ г.

Источник — Приказ Министра обороны РФ от 24.04.2010 № 100 (с изменениями и дополнениями на 2012 год)

Характеристика на депутата образец Характеристики как правильно составить Справочник юриста

» Характеристики как правильно составить

меню исследования

Предпочтения характеристик кандидатов в народные депутаты (15 февраля)

Рейтинг кандидатов в народные депутаты уверенно возглавил Иван Михайлович Бастрыга — выходец из села, на протяжении десятилетий возглавляющий одно из крупнейших стабильно работающих предприятий региона — Запорожский алюминиевый комбинат и лично сделавший очень много для социально-экономического развития нашего региона. Ему симпатизируют 29,7% избирателей, и он на 10,5% опережает ближайшего кандидата.

50. За какого кандидата в депутаты Верховной Рады намерены голосовать?

Тодорова Е. 39 x 03.49%

другого 29 x 02.60%

Куликова Н. 18 x 01.61%

Нет Ответа 272 xxxxxxxxxxxx 24.37%

Сводная по качествам:

Авторитетной личности 803 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx 71.95%

уже что-то сделавшему 781 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx 69.98%

хозяйственнику 750 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx 67.20%

защитнику интересов региона 745 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx 66.76%

известному до выборов 704 xxxxxxxxxxxxxxxxxxx 63.08%

имеющему опыт руководителя 668 xxxxxxxxxxxxxxxxxx 59.86%

Директору-промышленнику 578 xxxxxxxxxxxxxxxxx 51.79%

мужчине 555 xxxxxxxxxxxxxxxx 49.73%

Зрелому по возрасту 474 xxxxxxxxxxxxxxx 42.47%

жесткому деловому прагматику 465 xxxxxxxxxxxxxx 41.67%

молодому 433 xxxxxxxxxxxxx 38.80%

доброму и благожелательному человеку 432 xxxxxxxxxxx 38.71%

женщине 320 xxxxxxxxxx 28.67%

Руководителю-аграрию 253 xxxxxxxxx 22.67%

рабочему, крестьянину, труженику 228 xxxxxxxx 20.43%

еще не известному до выборов 197 xxxxxxx 17.65%

общественному деятелю 169 xxxxxx 15.14%

защитнику партийных интересов 163 xxxxx 14.61%

имеющему многообещающую программу 143 xxxx 12.81%

красивому по внешности 98 xxx 08.78%

Рассмотрим наиболее предпочтительные для избирателей характеристики депутатов на примере самого популярного на сегодняшний день кандидата в народные депутаты — Ивана Михайловича Бастрыги (или как его еще стали называть по-простому «Михайлыч»), которому симпатизируют почти тридцать процентов избирателей. Избиратели делали упор не только на его трудовой и жизненный опыт, но и на высокие душевные качества.

Обрисовывая идеальный образ народного избранника, большинство ставит во главу угла человечность и отзывчивость на чужую боль.

Когда-то говорили: «Хороший человек — не должность». Нужны, мол, прежде всего деловые качества. Сегодня народ на горьком опыте знает, что деловитость без доброты — это горе людям и слезы матерям. Нельзя размежевывать деловые и нравственные качества. И когда мы читаем в анкетах, что предпочтение И.Бастрыге отдается за «внимание к людям, к детям-сиротам и ветеранам», «стремление активизировать культурную и спортивную жизнь в городе», «спроможність зробити для нашого міста добру справу», «живет как простой человек», «порядочный, деловой», «честный, добрый, всегда держит свое слово, болеет душой за наш регион», «помогает людям», «помощь на деле», «беспокоится за население, улучшение благосостояния», «прагматизм, богатый опыт управления на высоком уровне, определенное влияние в обществе», «опытный, знает проблемы, которые нужно решать, настойчивый, напористый характер, желание работать, решать проблемы возраст не помеха!» и т.п. практически едва ли не в каждой третьей анкете, то убеждаешься: хорошие поступки не остаются незамеченными.

Среди всех характеристик понравившегося кандидата в народные депутаты можно отыскать и те, которые характерны не всем, а только одному или нескольким кандидатам. Такие характеристики выражают позиционирование кандидата, отличие их от других. Лучше выглядит самый своеобразный, уникальный и неповторимый кандидат, которого трудно перепутать с другим. Хуже, если одна характеристика подходит сразу нескольким кандидатам, их образы расплываются и наслаиваются друг на друга. Например, В.Арабаджи и Е.Тодорова отождествляют как «уже имевших опыт работы в Верховной Раде», Н.Куликова, А.Пономарева и С.Харченко — как «молодых новых предпринимателей», Е.Тодорова и Б.Бузова — как «борцов за всеобщее равенство и справедливость, за изменение существующего строя» и т.д. При таком клонировании общих образов для идентификации кандидата неожиданно добавляются совсем специфические характеристики — «футболист», «фермер», «уже два раза хотевший», «раньше был руховцем» и т.д.

Разброс мнений очень обширный, порой противоречивый, но в целом он дает представление о серьезных изменениях в приоритетах избирателей. Дефицит нравственности в среде действующих публичных политиков породил желание наделить законодательными функциями человека, который оказывает большую благотворительную деятельность, опытного хозяйственника, сторонника политической идеи возрождения регионов. Этот образ больше всего и подходит лидеру предвыборной гонки И.М.Бастрыге. Его ни с кем не перепутаешь.

ОБЩЕСТВЕННЫЙ ЦЕНТР НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ “СЕВЕРНОЕ ПРИАЗОВЬЕ” (рук.- д-р филос. проф. Могильный Сергей Аркадьевич )

ЛАБОРАТОРИЯ ПРОБЛЕМ ПРИМОРСКОГО ГОРОДА ИЭПИ НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК УКРАИНЫ (рук.- к.эк.н. доц. Гудзь Петр Васильевич )

При использовании материалов ссылка обязательна!

Why am I seeing this page?

404 means the file is not found. If you have already uploaded the file then the name may be misspelled or it is in a different folder.

Other Possible Causes

You may get a 404 error for images because you have Hot Link Protection turned on and the domain is not on the list of authorized domains.

If you go to your temporary url (http://ip/

username/) and get this error, there maybe a problem with the rule set stored in an .htaccess file. You can try renaming that file to .htaccess-backup and refreshing the site to see if that resolves the issue.

It is also possible that you have inadvertently deleted your document root or the your account may need to be recreated. Either way, please contact HostGator immediately via phone or live chat so we can diagnose the problem.

Are you using WordPress? See the Section on 404 errors after clicking a link in WordPress.

How to find the correct spelling and folder

Missing or Broken Files

When you get a 404 error be sure to check the URL that you are attempting to use in your browser.This tells the server what resource it should attempt to request.

http://example.com/example/Example/help.html

In this example the file must be in public_html/example/Example/

Notice that the CaSe is important in this example. On platforms that enforce case-sensitivity e xample and E xample are not the same locations.

For addon domains, the file must be in public_html/addondomain.com/example/Example/ and the names are case-sensitive.

When you have a missing image on your site you may see a box on your page with with a red X where the image is missing. Right click on the X and choose Properties. The properties will tell you the path and file name that cannot be found.

This varies by browser, if you do not see a box on your page with a red X try right clicking on the page, then select View Page Info, and goto the Media Tab.

http://example.com/images/banner.PNG

In this example the image file must be in public_html/images/

Notice that the CaSe is important in this example. On platforms that enforce case-sensitivity PNG and png are not the same locations.

404 Errors After Clicking WordPress Links

When working with WordPress, 404 Page Not Found errors can often occur when a new theme has been activated or when the rewrite rules in the .htaccess file have been altered.

Характеристика депутата образец — отличный вариант.

Описание:

Дрпутата может быть прекраснее живой, горячей человеческой мысли — с образца и сказал им — ее горем и радостью. Опубликовано 18.02.2014 автором admin. Семьянин посредственный, хотя и считает себя образцом. Образец обращения к депутату см. Это депутат духов, Это образец. Кадровое Агентство г. Москвы КАДРОВЫЙ РЕЗЕРВ приветствует Вас на своей страничке! У нас вы можете скачать образец характеристики с места жительства. Характеристика депутата образец рекендуеться к скачиванию. Получен очередной ответ от депутата В. Характеристика депутата образец быстрая загрузка. Опубликовано 12.02.2014 автором admin.

Содержание — аппарат правительства мурманской области

ЛЙНЕАГЕ-ЦЛАССЙЦ.СУ / view / Образец характеристики на депутата для награждения | Просмотров: 11165 | #22671

Ведомственные, отраслевые, региональные, казенные заслуги и даты награждений __________________________________________________ 9. Знатная грамота вручается в картонной папке, ну а в вариантах проведения торжественных событий в украшающей рамке со стеклом.

Ходатайства о награждении Почтенной грамотой, о объявлении Признательности имеют все шансы быть представлены председателем Архангельского областного Собрания депутатов, депутатами Архангельского областного Собрания депутатов, управляющим агрегата Архангельского областного Собрания депутатов, органами казенной власти Архангельской области, органами районного самоуправления городских образований Архангельской области, руководителями организаций самостоятельно от их организационно-правовых форм и форм принадлежности, публичными соединениями. Учет и регистрация награждения Почтенной грамотой, объявления Признательности, вручения знатного символа За награды в законотворчестве исполняются агрегатом Архангельского областного Собрания депутатов. Знатная грамота вручается в картонной папке, ну а в вариантах проведения торжественных событий в украшающей рамке со стеклом.

Образец заполнения представления к награждению. В заключительной части характеристики следует написать информацию о .

Областное Собрание депутатов постановляет. Установленный образец бланка Почетной грамоты приведен в приложении N 1 к. Ходатайства о награждении Почетной грамотой, об объявлении .

Депутаты Череповца в ЗСО. К награждению НАГРАДАМИ МЭРА ГОРОДА — за 20 дней до предполагаемой даты. Характеристика – описание характерных, отличительных качеств, черт кого- нибудь .

Черта оформляется в официально-деловом стиле в соответствии с нормами российского литературного языка (недоступность речевых повторов, неточности словоупотребления, грамматических, стилистических, орфографических и пунктуационных погрешностей, корректировок). Специфики: стиль задает взыскательную нормированность, регламентируя возведение, составляющие содержания, лексику и грамматический строй слова. Установленный эталон бумаги Признательности приведен в прибавлении 2 к истинному положению. Комиссия создается постановлением председателя Архангельского областного Собрания депутатов, при всем при этом в состав комиссии обязаны входить минимум нежели по 1 члену от любой фракции, работающей в Архангельском областном Собрании депутатов. Рельефное изображение помещения Архангельского областного Собрания депутатов, рельефные надписи Архангельское областное Собрание депутатов и За награды в законотворчестве имеют расцветка сплава. Иванович в металлургической секторе экономики отработал выше 45 лет, из них 30 лет на предприятии (), где прошел путь от вальцовщика. цеха до начальника тех. отдела заместителя крупнейшего инженера»: как сделать выписку из трудового договора образец. Наградная черта официальный документ, имеющий неопровержимое (с точными образцами) описание деловых и личностных достоинств награждаемого, его точных наград перед предприятием (мегаполисом, областью) за последние 3 5 лет, являющихся причиной для награждения.

Установленный прототип бумаги Почтенной грамоты приведен в прибавлении 1 к реальному положению. На протяжении календарного года Признательность быть может заявлена: 1) по представлению председателя Архангельского областного Собрания депутатов максимум 15 жителям или же коллективам организаций 2) по представлению депутата Архангельского областного Собрания депутатов максимум 8 жителям или же коллективам организаций 3) по представлению органов районного самоуправления городских образований Архангельской области максимум 4 горожанам либо коллективам организаций от любого городского образования Архангельской области 4) по представлению глав организаций с количеством сотрудников наиболее 1000 человек менее 7 господам либо коллективам организаций 5) по представлению любого из других организаторов награждения, предписанных в пт 5 истинного положения, менее 4 жителям или же коллективам организаций. Наградные мат-лы обязаны быть осмотрены на протяжении месяца со дня получения Архангельским областным Собранием депутатов ходатайства о награждении Почтенной грамотой либо о объявлении Признательности

Положение о наградах архангельского областного собрания

Образец характеристики на депутата для награждения. Оценка: 98 / 100 Всего: 7 оценок.

Другие новости по теме:

— Нестеренко отметил, что с юридической точки зрения. Что соблюдена письменная форма договора займа, либо если. Имеет ли силу расписка не заверенная нотариусом ,не имеющая подписи .

— Образец договора займа (примерная форма). Договор составлен в двух экземплярах, имеющих одинаковую юридическую силу, по одному экземпляру .

— Образцы расписок и ДКП составить, распечатать и согласовать с. В двух экземплярах, имеющих одинаковую юридическую силу.

— Образец Расписка в получении денежных средств за оказание. Имеющих одинаковую юридическую силу, по одному для каждого из .

Характеристика на сотрудника с места работы для предъявления по месту требования составляется на фирменном бланке организации. Желательно указать побольше реквизитов организации и исходящий номер.

Характеристика с работы — это не характеристика человека, а характеристика сотрудника, то есть — производственная характеристика! Форма характеристики дана ниже, а если вы хотите усвоить, как писать характеристику, то рекомендуем статью: Как составить характеристику на работника .

Характеристика заверяется подписью руководителя организации и, при необходимости, подписью непосредственного начальника лица, на которого составлена характеристика. На характеристике ставится печать организации. Характеристика составляется в двух экземплярах: первый — сотруднику, второй — остаётся в кадровой службе организации.

Источники:
archive.univector.net, ugkexpert.ru, kkluga.ru, lineage-classic.su, www.vorcuta.ru

Следующие статьи:

21 ноября 2021 года

Комментариев пока нет!

Отказ от части наследства не допускается

Сколько стоит оформление наследства по закону

Отказ от наследства как вернуть все обратно

Характеристика на кандидата, поступающего военное учебное заведение ( 11 класс )

ХАРАКТЕРИСТИКА на кандидата, поступающего в военное учебное заведение Я, Елена Сергеевна Бирючина ,07.06.1981 года рождения, образование высшее, классный руководитель 11 класса, учитель МБОУ Урывской СОШ, Каменского района, Ростовской области, контактный телефон 89286277848 лично знаю Андрея Эдуардовича Гараева с 2014года. Характеристика на кандидата, поступающего военное учебное заведение Гараева Андрея Эдуардовича, 23.12.1999 года рождения, учащегося 11 класса МБОУ Урывской СОШ, проживающего по адресу: Ростовская область, Каменский район, хутор Урывский, улица Российская, дом 50. Гараев Андрей обучается в Урывской средней школе с 1 класса. За время обучения в школе показал хорошие и удовлетворительные знания . По характеру Андрей уравновешен, спокоен. Со сверстниками общителен, взаимоотношения с одноклассниками ровные. К конфликтам не склонен, трудолюбив, дисциплинирован, настойчив, целеустремлен. Андрей всегда внимательно относится к критическим замечаниям и советам, старается исправлять свои недостатки, готов постоять за себя, защитить слабого и младшего по возрасту, смел, мужественен. В отношениях со взрослыми тактичен и вежлив, честен, Способен контролировать свои эмоции. Самооценка высокая, старается соблюдать принятые правила и нормы. К обязанностям, возложенным на него, относится добросовестно, лидерской позиции не занимает, но авторитетом в классном и школьном коллективах пользуется. Физически развит , спортивен, всегда аккуратен, опрятен. Является постоянным участником всех спортивных как школьных, так и районных мероприятий. Неоднократно занимал призовые места. Андрей воспитывается в полной семье. Атмосфера в семье доброжелательная, отношения очень ровные, доверительные. Директор школы: _______________ Некрасова М.С. Классный руководитель: _________ Бирючина Е.С.

Черты кандидата и политический выбор

Барбер, Дж. Д. 1972. Президентский персонаж . Энглвуд Клиффс, Нью-Джерси: Прентис-Холл. Найдите этот ресурс:

Бартельс, Л. М. 2002. Влияние особенностей кандидата на президентских выборах в США. В A. King (Ed.), Личности лидеров и результаты демократических выборов (стр. 44–69). Оксфорд, Великобритания: Oxford University Press. Найдите этот ресурс:

Campbell, J. E. 2000. Американская кампания: U.С. Президентские кампании и всенародное голосование . College Station: Texas A&M University Press. Найдите этот ресурс:

Carr, H. A., and F. A. Kingsbury. 1938. Понятие о чертах характера. Psychological Review , 45, 497–524. Найдите этот ресурс:

Коста, П. Т., младший, и Р. Р. Маккрей. 1992a. NEO PR-R профессиональное руководство . Одесса, Флорида: Ресурсы по психологической оценке. Найдите этот ресурс:

Коста, П. Т., младший, и Р. Р. МакКрей. 1992b. Четыре основных фактора — пять факторов. Личность и индивидуальные различия , 135, 653–665. Найдите этот ресурс:

Де Раад, Б. 2000. Большая пятерка личностных факторов: Психолексический подход к личности . Сиэтл, Вашингтон: Хогрефе и Хубер. Найдите этот ресурс:

Фиск, С. Т., и Тейлор, С. Е. 1991. Социальное познание (2-е изд.). Нью-Йорк: McGraw-Hill. Найдите этот ресурс:

Funk, C. L. 1996. Понимание выводов признаков в изображениях-кандидатах. В М. X. Делли Карпини, Л.Хадди и Р. Ю. Шапиро (ред.), Исследования в области микрополитики: переосмысление рациональности , Vol. 5 (стр. 97–123). Гринвич, Коннектикут: JAI. Найдите этот ресурс:

Фридкин, К. Л., и П. Дж. Кенни. 2011. Роль качеств кандидата в кампаниях, Journal of Politics , 73, 61–73. Найдите этот ресурс:

Funk, C. L. 1999. Введение кандидата в модели оценки кандидатов. Journal of Politics , 61, 700–720. Найдите этот ресурс:

Geer, J. G.2006. В защиту негатива: Атакующая реклама в президентских кампаниях. Чикаго: Издательство Чикагского университета. Найдите этот ресурс:

Харди, Б. У. и К. Х. Джеймисон. 2005. Может ли опрос повлиять на восприятие качеств кандидата? Public Opinion Quarterly , 69, 725–743. Найдите этот ресурс:

Hayes, D. 2010. Выборочное голосование на выборах в сенат США. American Politics Research , 38, 1102–1129. Найдите этот ресурс:

Johnston, R., M.G. Hagen, and K.Х. Джеймисон. 2004. Президентские выборы 2000 года и основы партийной политики . Кембридж, Великобритания: Издательство Кембриджского университета. Найдите этот ресурс:

Кенски, К., Б. В. Харди и К. Х. Джеймисон. 2010. Победа Обамы: как СМИ, деньги и сообщения повлияли на выборы 2008 года . Нью-Йорк: Oxford University Press. Найдите этот ресурс:

Киндер, Д. Р. 1986. Возвращение к президентскому персонажу. В Р. Р. Лау и Д. О. Сирс (ред.), Политическое познание .Хиллсдейл, Нью-Джерси: Лоуренс Эрлбаум. Найдите этот ресурс:

Киндер, Д. Р., М. Д. Петерс, Р. П. Абельсон и С. Т. Фиск. 1980. Президентские прототипы. Политическое поведение , 2, 315–337. Найдите этот ресурс:

King, A. 2002. Действительно ли важны личности лидеров? В A. King (Ed.), Личности лидеров и результаты демократических выборов (стр. 1–43). Oxford: Oxford University Press. Найдите этот ресурс:

Lodge, M., and P. Stroh. (п.450) 1993. Внутри кабины мысленного голосования: модель процесса оценки кандидатов, основанная на впечатлениях. В С. Айенгаре и У. Макгуайре (ред.), Исследования в политической психологии (стр. 225–263). Дарем, Северная Каролина: издательство Duke University Press. Найдите этот ресурс:

Lupia, A., and M. D. McCubbins. 1998. Демократическая дилемма: могут ли граждане узнать то, что им нужно знать? Кембридж, Великобритания: Cambridge University Press. Найдите этот ресурс:

Miller, A. H., M. P. Wattenberg, and O.Маланчук. 1986. Схематическая оценка кандидатов в президенты. Обзор американской политической науки , 80, 521–540. Найдите этот ресурс:

Miller, W. E., and J. M. Shanks. 1982. Направления политики и президентское руководство: альтернативные объяснения выборов 1980 года. Британский журнал политических наук , 12, 299–356. Найдите этот ресурс:

Miller, W. E., and J. M. Shanks. 1996. Новый американский избиратель . Кембридж, Массачусетс: Издательство Гарвардского университета.Найдите этот ресурс:

Попкин С. Л. 1994. Рассуждающий избиратель: общение и убеждение в президентских кампаниях (2-е изд.). Чикаго: University of Chicago Press. Найдите этот ресурс:

Rahn, W., J. H. Aldrich, E. Borgida и J. L. Sullivan. 1990. Социально-когнитивная модель оценки кандидатов. В J. Ferejohn и J. Kuklinski (Eds.), Информация и демократические процессы (стр. 136–159). Шампейн: University of Illinois Press. Найдите этот ресурс:

Saucier, G., и Л. Р. Гольдберг. 2001. Лексические исследования факторов личности коренных народов: предпосылки, продукты и перспективы. Journal of Personality , 69, 847–878. Найдите этот ресурс:

Шанкс, Дж. М., и У. Э. Миллер. 1990. Направление политики и оценка эффективности: Дополнительные объяснения выборов Рейгана. Британский журнал политических наук , 20, 143–235. Найдите этот ресурс:

Шанкс, Дж. М. и У. Э. Миллер. (1991). Приверженность, политика и эффективность: наследие Рейгана на выборах 1988 г. Британский журнал политических наук , 21 (2), 129–197. DOI: 10.1017 / S0007123400006098 Найдите этот ресурс:

Сосник, М. Дж., М. Дж. Дауд и Р. Фурнье. 2006. Applebee’s America . Нью-Йорк: Simon & Schuster. Найдите этот ресурс:

Выделение и характеристика гена-кандидата на болезнь Норри

Norrie, G. Acta Ophthalmol. 5 , 357–386 (1927).

Артикул Google ученый

Варбург.М. Acta Ophthalmol. (Дополнение) 89 , 1–47 (1966).

Google ученый

de la Chapelle, A., Sankila, E.-M., Lindof, M., Aula, P. & Norio, R. Clin. Genet. 28 , 317–320 (1985).

CAS Статья Google ученый

Гал, А., Виринга, Б., Смитс, Д.Ф., Бликер-Вейджмейкерс, Л.М. и Роперс, Х.Х. Cytogenet.ячейка Genet. 40 , 219–224 (1986).

Артикул Google ученый

Donnai, D., Mountford, R.C. & Рид, A.P. J. med. Genet. 25 , 73–78 (1988).

CAS Статья Google ученый

Чжу Д., Антонаракис С.Э., Шмекпепер Б.Дж., Дьергаард П.Дж., Греб А.Э. и Мауменее И.Х. Am. J. med.Genet. 33 , 485–488 (1989).

CAS Статья Google ученый

Sims, K.B. и др. . Нейрон 2 , 1069–1076 (1989).

CAS Статья Google ученый

Лан, Северная Каролина и др. . Genomics 4 , 552–559 (1989).

CAS Статья Google ученый

Симс, К.Б. и др. . Am. J. hum. Genet. 45 , 424–434 (1989).

CAS PubMed PubMed Central Google ученый

Дэвис, К.Е., Мандель, Ж.-Л., Монако, А.П., Нуссбаум, Р.Л. и Уиллард, Х.Ф. Cytogenet. ячейка Genet. 58 , 853–966 (1991).

Артикул Google ученый

Катаяма, С., Вольферд, М.И Голбус, М. Am. J. med. Genet. 30 , 967–970 (1988).

CAS Статья Google ученый

Ngo, J.T., Spence, A., Cortessis, V., Sparkes, R.S. И Bateman, J.B. Clin. Genet. 34 , 43–47 (1988).

CAS Статья Google ученый

Линдси, С. и др. . Hum. Genet. 88 , 349–350 (1992).

CAS Статья Google ученый

Чен, З.-Й. и др. . Cytogenet. ячейка Genet. 58 , 2060 (1991).

Google ученый

Chen, Z.-Y., Hsu, P.Y.-P., Powell, J.F., Hendriks, R.W., Breakefield, X.O. И Крейг, I.W. Cytogenet. ячейка Genet. 58 , 2059 (1991).

Google ученый

Чен, З-Й. и др. . Hum. мол. Genet. (в печати).

Sims, K.B. и др. . Hum. мол. Genet. (в печати).

Ларин, З., Монако, А.П. и Лехрах, Х. Proc. натн. Акад. Sci. США 88 , 4123–4127 (1991).

CAS Статья Google ученый

Козак, М. Nucleic Acids Res. 15 , 8125–8148 (1987).

CAS Статья Google ученый

Breathnach, R. & Chambon, P. Ann. Rev. Biochem. 50 , 349–383 (1981).

CAS Статья Google ученый

Дудов К.П. И Перри, Р. П. Cell 37 , 457–468 (1984).

CAS Статья Google ученый

Фикетт, Дж.W. Nucleic Acids Res. 10 , 5311–5318 (1982).

Артикул Google ученый

Коллинз, Ф.С. Nature Genet. 1 , 3–6 (1992).

CAS Статья Google ученый

Left, S.E., Rosenfeld, M.G. И Эванс, Р. Ann. Rev. Biochem. 55 , 1092–1117 (1986).

Google ученый

Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. Молекулярное клонирование: лабораторное руководство . 2-е изд. (Издательство Cold Spring Harbor Laboratory Press, Нью-Йорк, 1989).

Google ученый

Feinberg, A.P. & Vogelstein, B. Anal. Biochem. 132 , 6–13 (1983).

CAS Статья Google ученый

Сили П.Г., Уиттакер П.А. И Саузерн, Э.М. Nucleic Acids Res. 13 , 1905–1922 (1985).

CAS Статья Google ученый

Церковь, G.M. & Gilbert, W. Proc. натн. Акад. Sci. США 81 , 1991–1995 (1984).

CAS Статья Google ученый

Anand, R., Riley, J.H., Butler, R., Smith, J.C. & Markham, A.F. Nucleic Acids Res. 18 , 1951–1956 (1990).

CAS Статья Google ученый

Саузерн, Э.М., Ананд, Р., Браун, W.R.A. И Флетчер, Д.С. Nucleic Acids Res. 15 , 5925–5943 (1987).

CAS Статья Google ученый

Росс М.Т., Баллабио А. и Крейг И.В. Геномика 6 , 528–539 (1990).

CAS Статья Google ученый

Натанс, Дж., Томас, Д. и Хогнесс, Д.С. Наука 232 , 193–202 (1986).

CAS Статья Google ученый

Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A.R. Proc. натн. Акад. Sci. США 74 , 5463–5467 (1977).

CAS Статья Google ученый

Лунд, Э. и др. . Molec. клетка. Биол. 3 , 2211–2220 (1983).

CAS Статья Google ученый

Пови, С. и др. . Ann. гул. Genet. 43 , 241–248 (1980).

CAS Статья Google ученый

Характеристика гена-кандидата bcl-1.

Mol Cell Biol. 1991 Oct; 11 (10): 4846–4853.

Медицинский факультет Калифорнийского университета в Сан-Франциско.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Транслокация t (11; 14) (q13; q32) была связана со злокачественными опухолями В-лимфоцитов человека. Было клонировано несколько примеров этой транслокации, что свидетельствует о том, что эта аномалия соединяет ген тяжелой цепи иммуноглобулина с локусом bcl-1 на хромосоме 11. Однако идентификация гена bcl-1, предполагаемого доминантного онкогена, была неуловимой.В этой работе мы выделили геномные клоны, покрывающие 120 т.п.н. локуса bcl-1. Зонды из области островка крошечных фрагментов HpaII идентифицировали ген-кандидат bcl-1. кДНК, представляющие мРНК bcl-1, клонировали из трех клеточных линий, две из которых имели транслокацию. Установленная аминокислотная последовательность этих клонов показала, что bcl-1 является членом семейства генов циклинов. Кроме того, наш анализ экспрессии bcl-1 в обширной панели линий клеток человека показал, что он широко экспрессируется, за исключением лимфоидных или миелоидных клонов.Это наблюдение может обеспечить молекулярную основу для различных способов контроля клеточного цикла в различных тканях млекопитающих. Активация гена bcl-1 может быть онкогенной за счет прямого изменения прохождения клеточного цикла.

Полный текст

Полный текст доступен в виде отсканированной копии оригинальной печатной версии. Получите копию для печати (файл PDF) полной статьи (1,7M) или щелкните изображение страницы ниже, чтобы просмотреть страницу за страницей. Ссылки на PubMed также доступны для Избранные ссылки .

Изображения в этой статье

Щелкните изображение, чтобы увидеть его в увеличенном виде.

Избранные ссылки

Эти ссылки находятся в PubMed. Это может быть не полный список ссылок из этой статьи.

Али IU, Мерло Г., Каллахан Р., Лидеро Р. Блок амплификации на хромосоме 11q13 в агрессивных первичных опухолях молочной железы человека включает в себя локусы bcl-1, int-2 и hst. Онкоген. 1989 Янв; 4 (1): 89–92. [PubMed] [Google Scholar]
Бахши А., Дженсен Дж. П., Голдман П., Райт Дж. Дж., Макбрайд О. В., Эпштейн А. Л., Корсмейер С. Дж.Клонирование хромосомной точки разрыва t (14; 18) лимфом человека: кластеризация вокруг JH на 14 хромосоме и рядом с единицей транскрипции на 18. Cell. Июль 1985 г.; 41 (3): 899–906. [PubMed] [Google Scholar]
Беренсон-младший, Ян Дж., Микель Р.А. Частая амплификация локуса bcl-1 при плоскоклеточном раке головы и шеи. Онкоген. Сентябрь 1989 г .; 4 (9): 1111–1116. [PubMed] [Google Scholar]
Епископ Дж. Молекулярные темы в онкогенезе. Клетка. 1991 25 января; 64 (2): 235–248. [PubMed] [Google Scholar]
Карл Г.Ф., Франк М., Олсон М.В.Электрофоретическое разделение больших молекул ДНК путем периодической инверсии электрического поля. Наука. 1986, 4 апреля; 232 (4746): 65–68. [PubMed] [Google Scholar]
Cleary ML, Smith SD, Sklar J. Клонирование и структурный анализ кДНК для bcl-2 и гибридного транскрипта bcl-2 / иммуноглобулина, полученного в результате транслокации t (14; 18). Клетка. 1986, 10 октября; 47 (1): 19–28. [PubMed] [Google Scholar]
Evans T, Rosenthal ET, Youngblom J, Distel D, Hunt T. Циклин: белок, определяемый материнской мРНК в яйцах морского ежа, который разрушается при каждом делении расщепления.Клетка. 1983 июн; 33 (2): 389–396. [PubMed] [Google Scholar]
Frischauf AM, Lehrach H, Poustka A, Murray N. Лямбда-замещающие векторы, несущие полилинкерные последовательности. J Mol Biol. 1983, 15 ноября; 170 (4): 827–842. [PubMed] [Google Scholar]
Fukuhara S, Rowley JD, Variakojis D, Golomb HM. Хромосомные аномалии при низкодифференцированной лимфоцитарной лимфоме. Cancer Res. 1979, август; 39 (8): 3119–3128. [PubMed] [Google Scholar]
Гардинер К., Лаас В., Паттерсон Д. Фракционирование крупных рестрикционных фрагментов ДНК млекопитающих с использованием гель-электрофореза в вертикальном градиенте импульсного поля.Somat Cell Mol Genet. 1986 Март; 12 (2): 185–195. [PubMed] [Google Scholar]
Gubler U, Hoffman BJ. Простой и очень эффективный метод создания библиотек кДНК. Ген. 1983 ноябрь; 25 (2-3): 263–269. [PubMed] [Google Scholar]
Hayday AC, Gillies SD, Saito H, Wood C, Wiman K, Hayward WS, Tonegawa S. Активация транслоцированного гена c-myc человека энхансером в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина. Природа. 307 (5949): 334–340. [PubMed] [Google Scholar]
Klein G, Klein E.Эволюция опухолей и влияние молекулярной онкологии. Природа. 1985 16 мая; 315 (6016): 190–195. [PubMed] [Google Scholar]
Koduru PR, Offit K, Filippa DA. Молекулярный анализ разрывов протоонкогена BCL-1 в B-клеточных лимфомах с аномалиями 11q13. Онкоген. Июль 1989 г .; 4 (7): 929–934. [PubMed] [Google Scholar]
Козак М. По крайней мере шесть нуклеотидов, предшествующих кодону инициатора AUG, усиливают трансляцию в клетках млекопитающих. J Mol Biol. 1987 20 августа; 196 (4): 947–950. [PubMed] [Google Scholar]
Kraft R, Tardiff J, Krauter KS, Leinwand LA.Использование мини-препа плазмидной ДНК для секвенирования двухцепочечных матриц с помощью Sequenase. Биотехники. 1988 июн; 6 (6): 544–549. [PubMed] [Google Scholar]
Lammie GA, Fantl V, Smith R, Schuuring E, Brookes S, Michalides R, Dickson C, Arnold A, Peters G. Предполагаемый онкоген D11S287 на хромосоме 11q13 амплифицируется и экспрессируется в плоскоклеточный рак и карциномы молочной железы, связанный с BCL-1. Онкоген. 1991 Март; 6 (3): 439–444. [PubMed] [Google Scholar]
Ледер П., Бэтти Дж., Ленуар Дж., Молдинг К., Мерфи В., Поттер Г., Стюарт Т., Тауб Р.Транслокации между генами антител при раке человека. Наука. 18 ноября 1983 г.; 222 (4625): 765–771. [PubMed] [Google Scholar]
Lehner CF, O’Farrell PH. Экспрессия и функция циклина А дрозофилы во время эмбрионального клеточного цикла. Клетка. 24 марта 1989 г.; 56 (6): 957–968. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Lindsay S, Bird AP. Использование рестрикционных ферментов для обнаружения потенциальных последовательностей генов в ДНК млекопитающих. Природа. 327 (6120): 336–338. [PubMed] [Google Scholar]
Matsushime H, Roussel MF, Ashmun RA, Sherr CJ.Колониестимулирующий фактор 1 регулирует новые циклины во время фазы G1 клеточного цикла. Клетка. 1991 17 мая; 65 (4): 701–713. [PubMed] [Google Scholar]
Медейрос LJ, Ван Крикен JH, Jaffe ES, Raffeld M. Ассоциация перестроек bcl-1 с лимфоцитарной лимфомой промежуточной дифференцировки. Кровь. 1990, 15 ноября; 76 (10): 2086–2090. [PubMed] [Google Scholar]
Meeker TC, Grimaldi JC, O’Rourke R, Louie E, Juliusson G, Einhorn S. Дополнительная область точки останова в локусе BCL-1, связанная с t (11; 14) (q13 ; q32) транслокация В-лимфоцитарной злокачественной опухоли.Кровь. 1989 Октябрь; 74 (5): 1801–1806. [PubMed] [Google Scholar]
Микер Т.С., Леб Дж., Эйрес М., Селлерс В. Ген Pim-1 человека избирательно транскрибируется в различных линиях гематолимфоидных клеток, несмотря на промотор, богатый G + C. Mol Cell Biol. 1990 апр; 10 (4): 1680–1688. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Minshull J, Golsteyn R, Hill CS, Hunt T. Киназы cdc2, ассоциированные с циклином A- и B-типа, у Xenopus включаются и выключаются в разное время клеточного цикла .EMBO J., сентябрь 1990 г .; 9 (9): 2865–2875. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Мотокура Т., Блум Т., Ким Х. Г., Юппнер Х., Рудерман Дж. В., Кроненберг Х. М., Арнольд А. Новый циклин, кодируемый онкогеном-кандидатом, связанным с bcl1. Природа. 1991, 11 апреля; 350 (6318): 512–515. [PubMed] [Google Scholar]
Мюррей А.В., Киршнер М.В. Синтез циклина запускает ранний цикл эмбриональных клеток. Природа. 25 мая 1989 г., 339 (6222): 275–280. [PubMed] [Google Scholar]
Нисида К., Таниваки М., Мисава С., Абэ Т.Неслучайная перестройка хромосомы 14 в полосе q32.33 при злокачественных лимфоидных опухолях человека со зрелым В-клеточным фенотипом. Cancer Res. 1 марта 1989 г .; 49 (5): 1275–1281. [PubMed] [Google Scholar]
Пирсон WR, Lipman DJ. Улучшенные инструменты для сравнения биологической последовательности. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1988 Apr; 85 (8): 2444–2448. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Pines J, Hunter T. Циклин A человека представляет собой белок p60, связанный с аденовирусом E1A, и ведет себя иначе, чем циклин B. Nature.23 августа 1990 г .; 346 (6286): 760–763. [PubMed] [Google Scholar]
Rimokh R, Berger F, Cornillet P, Wahbi K, Rouault JP, Ffrench M, Bryon PA, Gadoux M, Gentilhomme O, Germain D, et al. Разрыв в локусе BCL1 тесно связан с промежуточным подтипом лимфоцитарной лимфомы. Гены Хромосомы Рак. 1990 сентябрь; 2 (3): 223–226. [PubMed] [Google Scholar]
Rosenberg CL, Kim HG, Shows TB, Kronenberg HM, Arnold A. Перестройка и сверхэкспрессия D11S287E, онкогена-кандидата на хромосоме 11q13 в доброкачественных опухолях паращитовидной железы.Онкоген. 1991 Март; 6 (3): 449–453. [PubMed] [Google Scholar]
Senapathy P, Shapiro MB, Harris NL. Соединения сплайсинга, сайты точек ветвления и экзоны: статистика последовательностей, идентификация и приложения в геномном проекте. Методы Энзимол. 1990; 183: 252–278. [PubMed] [Google Scholar]
Showe LC, Croce CM. Роль хромосомных транслокаций в В- и Т-клеточной неоплазии. Анну Рев Иммунол. 1987. 5: 253–277. [PubMed] [Google Scholar]
Штивельман Э., епископ Дж. М.. Влияние транслокаций на транскрипцию из PVT.Mol Cell Biol. 1990 апр; 10 (4): 1835–1839. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Штивельман Э., Лифшиц Б., Гейл Р. П., Канаани Э. Слитый транскрипт генов abl и bcr при хроническом миелогенном лейкозе. Природа. 13 июня 1985 г .; 315 (6020): 550–554. [PubMed] [Google Scholar]
Свенсон К.И., Фаррелл К.М., Рудерман СП. Белок зародыша моллюска циклин А вызывает переход в фазу М и возобновление мейоза в ооцитах Xenopus. Клетка. 26 декабря 1986 г .; 47 (6): 861–870. [PubMed] [Google Scholar]
Theillet C, Adnane J, Szepetowski P, Simon MP, Jeanteur P, Birnbaum D, Gaudray P.BCL-1 участвует в амплификации 11q13, обнаруженной при раке груди. Онкоген. 1990 Янв; 5 (1): 147–149. [PubMed] [Google Scholar]
Tso JY, Sun XH, Kao TH, Reece KS, Wu R. Выделение и характеристика кДНК глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы крысы и человека: сложность генома и молекулярная эволюция гена. Nucleic Acids Res. 1985, 11 апреля; 13 (7): 2485–2502. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Tsujimoto Y, Jaffe E, Cossman J, Gorham J, Nowell PC, Croce CM.Кластеризация точек останова на хромосоме 11 в В-клеточных новообразованиях человека с транслокацией хромосомы t (11; 14). Природа. 1985 23 мая; 315 (6017): 340–343. [PubMed] [Google Scholar]
Цудзимото Ю., Юнис Дж., Онорато-Шоу Л., Эриксон Дж., Ноуэлл П.С., Кроче С.М. Молекулярное клонирование точки разрыва хромосомы В-клеточных лимфом и лейкозов с транслокацией t (11; 14) хромосомы. Наука. 1984, 29 июня; 224 (4656): 1403–1406. [PubMed] [Google Scholar]
Ван Ден Берг Х., Парлуар К., Дэвид Дж., Мишо Дж. Л., Сокал Г.Новая характерная кариотипическая аномалия при лимфопролиферативных заболеваниях. Рак. Июль 1979 г.; 44 (1): 188–195. [PubMed] [Google Scholar]
Ван Дж., Шенивесс Х, Хенглейн Б, Брешо С. Интеграция вируса гепатита В в ген циклина А в гепатоцеллюлярной карциноме. Природа. 1990 8 февраля; 343 (6258): 555–557. [PubMed] [Google Scholar]
Weisenburger DD, Sanger WG, Armitage JO, Purtilo DT. Промежуточная лимфоцитарная лимфома: иммунофенотипические и цитогенетические данные. Кровь. 1987 июн; 69 (6): 1617–1621.[PubMed] [Google Scholar]
Whitfield WG, González C, Sánchez-Herrero E, Glover DM. Транскрипты одного из двух генов циклинов Drosophila локализуются в полюсных клетках во время эмбриогенеза. Природа. 23 марта 1989 г., 338 (6213): 337–340. [PubMed] [Google Scholar]
Williams ME, Westermann CD, Swerdlow SH. Генотипическая характеристика центроцитарной лимфомы: частая перестройка локуса bcl-1 хромосомы 11. Кровь. 1 октября 1990 г.; 76 (7): 1387–1391. [PubMed] [Google Scholar]
Xiong Y, Connolly T, Futcher B, Beach D.Циклин D-типа человека. Клетка. 1991 17 мая; 65 (4): 691–699. [PubMed] [Google Scholar]
Яниш-Перрон С., Виейра Дж., Мессинг Дж. Улучшенные векторы для клонирования фага M13 и штаммы-хозяева: нуклеотидные последовательности векторов M13mp18 и pUC19. Ген. 1985. 33 (1): 103–119. [PubMed] [Google Scholar]
Зинн К., ДиМайо Д., Маниатис Т. Идентификация двух различных регуляторных областей, смежных с геном бета-интерферона человека. Клетка. Октябрь 1983 г.; 34 (3): 865–879. [PubMed] [Google Scholar]

Здесь представлены статьи по молекулярной и клеточной биологии, любезно предоставленные Американским обществом микробиологов (ASM)

Отбор кандидатов и характеристика API

Каковы некоторые ключевые соображения при выборе соединения-кандидата?

Перед тем, как отправиться в путешествие, нормально провести небольшое исследование, полагаться на предыдущие знания, посмотреть на карту, рассмотреть тип транспорта и выяснить, какие вероятные нарушения или опасности на вашем маршруте, чтобы убедиться, что они могут быть устранены. избегали.

Разработка лекарства — это тоже путешествие. Вам нужно будет получить представление о том, где находится ваш кандидат, и о том, куда вы едете; каково целевое заболевание, группа пациентов, вероятный путь введения, профиль целевого продукта и, что важно, каковы потенциальные подводные камни на этом пути?

С самого начала, если, например, ваше соединение нестабильно по своей природе, имеет очень плохую растворимость или гигроскопично, вы знаете, что ваш путь к разработке продукта будет более сложным.Следовательно, поиск людей с нужными знаниями, навыками и технологиями будет важен для выявления и преодоления потенциальных препятствий. Чем раньше на вашем пути будут выявлены эти проблемы, тем лучше. Могут быть установлены простейшие и наиболее эффективные пути, сокращающие как время, так и затраты на разработку, или, когда это целесообразно, разработка соединения может быть остановлена и усилия сосредоточены на других молекулах, которые более перспективны.

После того, как ряд ведущих соединений идентифицирован, происходит процесс выбора, чтобы определить приоритетность того, какие соединения следует использовать.Фармацевтические и биотехнологические компании используют разные подходы к своей ранней разработке, и выбранный подход может основываться на их внутреннем опыте, ресурсах, культуре, бюджете, сроках, доступности API и их отношении к риску. По нашему опыту в Quotient Sciences, мы наблюдаем, что задержка определения основных характеристик соединения может привести к серьезным проблемам на более позднем этапе разработки.

Подход Quotient Sciences к разработке продукта

Quotient Sciences применяет целостный подход с мультидисциплинарными группами разработчиков, состоящими из экспертов в области биофармацевтики, DMPK, материаловедения и разработки рецептур, объединенных вместе, чтобы помочь в управлении процессом.На ранней стадии скрининга наши гибкие подходы всегда адаптированы к молекуле и пути доставки, зависят от данных и технологий. Мы помним, что стратегии должны быть поэтапными, рентабельными и быстрыми.

Для твердых пероральных систем доставки важно сначала охарактеризовать твердотельные свойства входящего API с использованием ряда аналитических методов. Мы понимаем, что на самых ранних стадиях разработки API может быть в дефиците, и синтез нескольких партий может давать несколько разные свойства, включая степень кристалличности, полиморфизм, чистоту, размер частиц, морфологию и смачиваемость.Эти изменения могут повлиять на ваши первоначальные исследования токсичности, и поэтому понимание ваших ранних партий поможет в устранении неполадок и настройке спецификации после того, как будет установлен валидированный синтетический маршрут.

Часто на этой стадии АФИ является аморфным или частично кристаллическим. Таким образом, одним из основных ранних драйверов проекта является получение кристаллической формы, позволяющей очистить API как часть процесса производства API, и поэтому нам часто ставят задачу выполнить начальный экран кристаллизации в качестве первого шага.Эти быстрые скрининги используются для получения раннего указания на полиморфную тенденцию молекулы.

Затем, вероятно, будет инициирован анализ растворимости с целью определения растворимости в различных pH, биорелевантных средах и обычных технологических растворителях. Если растворимость низкая и может повлиять на биодоступность, было бы разумно изучить возможность повышения растворимости за счет модификации свойств твердого тела или солевой формы API, прежде чем принимать дополнительные растворы для улучшения состава для улучшения растворимости (например, аморфное твердое вещество дисперсии).

Если API содержит ионизируемые группы, можно также рассмотреть возможность использования солевого экрана. Модификация свободной формы или изменение формы соли может придать API многие полезные свойства, не в последнюю очередь растворимость, кристалличность и стабильность. Мы проектируем наши солевые экраны с вашей молекулой в ядре, и исследуемые противоионы выбираются на основе нескольких факторов, а не только pKa вашей молекулы. Мы также учитываем молекулярную массу, вероятную дозу и возможный процесс приготовления, чтобы обеспечить оптимальный результат в самых разных условиях с использованием только минимальных количеств API.

Этот подход к скринингу предпочитается в Quotient Sciences из-за его быстрого времени выполнения и обычно он использует только количества API в миллиграммах на эксперимент, в то же время позволяя провести значимую характеристику. На основе полученных результатов потенциальные совпадения затем устанавливаются по приоритету для масштабирования, чтобы обеспечить более подробную характеристику твердого тела, выбор и сравнение с исходным входным API.

На определенном этапе процесса разработки, вероятно, потребуется понимание любого потенциального полиморфизма вашего API, поскольку это может повлиять на многие важные последующие аспекты, включая качество, технологичность, биодоступность, безопасность и производительность вашего продукта.Сроки характеристики полиморфизма могут зависеть от поставки API, сроков и бюджета, однако, по нашему опыту, это должно быть выполнено как можно раньше. Неожиданные изменения в API во время разработки или производства рецептуры могут привести к дорогостоящим и длительным задержкам в планах разработки.

Как и в случае определения характеристик твердого тела, наши экраны полиморфизма разработаны с учетом API. Хотя изначально может показаться безграничная возможность использования растворителей, наш опыт показал, что при использовании обычных технологических систем растворителей / смесей растворителей и концентрации внимания на нескольких кинетических и термодинамических процессах кристаллизации будут определены наиболее подходящие формы.Другое преимущество этого подхода по сравнению с другими высокопроизводительными ситами, опосредованными растворителем, состоит в том, что он позволяет идентифицировать проблемы обработки рецептуры, чтобы их можно было смягчить до того, как начнется разработка дорогостоящей рецептуры.

После того, как кандидат выбран, может быть проведено дополнительное тестирование. Например, могут быть проведены исследования ускоренной принудительной деградации, чтобы гарантировать целостность выбранной формы, могут быть выполнены начальные проверки совместимости наполнителей для выявления возможных неблагоприятных взаимодействий во время разработки состава.Наша команда по моделированию и имитационному моделированию также может проводить исследования фармакокинетики на физиологической основе (PBPK), чтобы обеспечить механистическое понимание вероятных характеристик и распределения вашего лекарственного препарата in vivo и информировать о принятии решений, основанных на оценке риска, как в отношении рецептуры, так и клинического дизайна, что в конечном итоге снижает стоимость. развития.

Какие типичные подходы к определению характеристик твердого тела используются в экранах?

· Микроскопия в поляризованном свете — позволяет быстро определить и легко увидеть, присутствует ли кристаллический материал.Дополнительная информация о габитусе и размере кристалла также дает важную информацию, которая помогает принимать решения и планировать.

· Дифракция рентгеновских лучей на порошке — используется для определения кристаллической формы, а сигнатуры могут использоваться для отслеживания твердой формы с помощью различных процессов приготовления и стабильности.

· Динамическая сорбция паров — дает важную информацию о гигроскопичности соединения и образовании гидратов. Мы также регулярно используем динамическую сорбцию паров, чтобы понять смачиваемость API и изменчивость от партии к партии из-за незначительных изменений формы кристаллов.Эти свойства являются ключевыми при определении будущих условий хранения и обработки.

· Термогравиметрический анализ — используется для измерения изменений веса в температурном диапазоне. Это полезно для определения присутствия гидратов или сольватов, а также для определения температур разложения при использовании условий обработки, индуцированных нагреванием.

· Дифференциальная сканирующая калориметрия — используется для определения температуры плавления и чистоты нашего материала. Его также можно использовать для наших первоначальных скрининговых исследований совместимости наполнителей и определения стеклования для экранов / характеризации аморфных твердых дисперсий.

· Конфокальная рамановская спектроскопия и картирование — используется для идентификации твердой формы в составе, исследования изменений во время стабильности и, как правило, является отличным инструментом для помощи в исследованиях проблем, связанных с составом, стабильностью или технологией.

· Калориметрия раствора и перфузии — это методы измерения низкоуровневого дискриминирующего поверхностного расстройства и содержания аморфного вещества, которое также особенно необходимо для ингаляционных соединений, чтобы гарантировать контроль и понимание аморфного содержимого после микронизации.

Почему это важно для будущего развития компаунда?

Как обсуждалось в начале этой статьи, понимание и управление твердотельными свойствами вашего API является ключевой частью процесса выбора кандидата и разработки. На ранних этапах разработки скромные вложения в эти первоначальные исследования и рекомендации опытных ученых помогут вам на пути к разработке лекарств. Вы сможете накапливать знания о своем API, выявлять потенциальные ловушки и в конечном итоге снижать риски своей программы разработки, максимально быстро и эффективно доводя вас до конечного пункта назначения продукта.

Замена белка, стимулирующего макрофаги R689C

Abstract

В настоящее время высокопроизводительные полногеномные исследования ассоциаций (GWAS) определяют большое количество локусов генома, связанных с риском общих заболеваний человека. Каждый такой локус представляет проблему при идентификации соответствующего основного механизма. Здесь мы сообщаем об экспериментальной характеристике предлагаемого причинного однонуклеотидного полиморфизма (SNP) в локусе, связанном с риском болезни Крона и язвенного колита.SNP находится в гене MST1, кодирующем белок, стимулирующий макрофаги (MSP), и приводит к замене аминокислоты R689C в β-цепи MSP (MSPβ). Связывание MSP с тирозинкиназой рецептора RON активирует сигнальные пути, участвующие в воспалительной реакции. Мы очистили белки MSPβ дикого типа и мутантные и сравнили биохимические и биофизические свойства, которые могут влиять на сигнальный путь MSP / RON. Исследования связывания с поверхностным плазмонным резонансом (SPR) показали, что сродство MSPβ R689C к RON примерно в 10 раз ниже, чем сродство MSPβ дикого типа, а дифференциальная сканирующая флуориметрия (DSF) показала, что термостабильность мутантного MSPβ была немного ниже, чем таковая. MSPβ дикого типа на 1.6 K. Было обнаружено, что замена не нарушает специфическое расщепление пептидной связи Arg483-Val484 матриптазой-1, необходимое для активации MSP, а масс-спектрометрия триптических фрагментов мутированного белка показала, что свободный тиол, введенный мутацией R689C, не действует. образуют аберрантную дисульфидную связь. В совокупности исследования показывают, что миссенс-SNP нарушает функцию MSP, снижая его сродство к RON и, возможно, за счет вторичного эффекта на концентрацию in vivo , возникающего из-за снижения термодинамической стабильности, что приводит к подавлению регуляции сигнального пути MSP / RON.

Образец цитирования: Горлатова Н., Чао К., Пал Л.Р., Арай Р.Х., Галкин А., Турко И. и др. (2011) Белковая характеристика SNP-кандидата механизма болезни Крона: замена белка R689C, стимулирующего макрофаги. PLoS ONE 6 (11): e27269. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0027269

Редактор: Андреас Хофманн, Университет Гриффита, Австралия

Поступила: 19 сентября 2011 г .; Одобрена: 13 октября 2011 г .; Опубликовано: 7 ноября 2011 г.

Авторские права: © 2011 Gorlatova et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH) R21-DA027024, R01-GM087922, R01LM007174 (URL: http://grants.nih.gov/grants/oer.htm). RHA была удостоена награды HHMI (Медицинский институт Говарда Хьюза) для студентов бакалавриата.Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

До недавнего времени информация о том, какие варианты в геноме человека способствуют повышенному риску распространенных заболеваний человека, была фрагментарной и часто статистически слабой. Новые технологии на основе чипов теперь предоставляют относительно объективную и надежную информацию о том, какие однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) в значительной степени связаны с изменением риска ряда распространенных заболеваний.Текущее поколение GWAS обычно включает несколько тысяч человек с интересующим заболеванием и такое же количество контрольных лиц без заболевания (например, [1]). Эти исследования, а также недавние мета-исследования, объединяющие данные ряда отдельных экспериментов [2], [3], уже привели к идентификации до 100 локусов, связанных с риском для некоторых отдельных заболеваний. Эти новые данные открывают возможность более глубокого понимания природы комплексного заболевания и последующего прогресса в лечении, диагностике, прогнозе и профилактике.Идентификация механизма, лежащего в основе каждого локуса риска, нетривиальна, поскольку типичный микромассив содержит комплементарные олигонуклеотиды только для 500000 — миллиона общих SNP (тех, у которых частота аллелей популяции превышает 1%), в то время как количество известных общих SNP больше чем в 10 раз больше (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/). Таким образом, маловероятно, что отобранный (теговый) SNP, связанный с измененным риском заболевания («маркерный» SNP), на самом деле играет прямую роль в механизме заболевания.Скорее, из-за неполной рекомбинации в популяции присутствие маркерного SNP будет коррелировать с наличием генетического варианта, фактически влияющего на функцию in vivo , через неравновесие по сцеплению (LD). Для любого данного маркера, связанного с повышенным риском заболевания, каждый из SNP в LD является кандидатом на участие в механизме заболевания. Диапазон LD широко варьирует по геному, и, таким образом, количество SNP-кандидатов также изменяется, примерно от 100 до порядка 10 000 в сильно сцепленной области MHC хромосомы 6 (Pal and Moult, неопубликовано).

Вероятно, что в каждом локусе не более одного из множества SNP-кандидатов участвует в механизме заболевания. Также возможно, что в любом данном локусе ни один из идентифицированных SNP-кандидатов не является механизмом по ряду причин. Механизм SNP может напрямую влиять на фенотип и, следовательно, на риск заболевания посредством ряда известных процессов, таких как аминокислотные замены, изменяющие функцию белка in vivo , изменение уровня мРНК через влияние на связывание фактора транскрипции, действие микроРНК, период полужизни сообщения или сплайсинг. и изменила эффективность трансляции за счет воздействия на структуру мРНК и эффективность кодонов.Хотя большинство локусов, связанных с заболеванием, включают в себя один или несколько генов, некоторые из них находятся в так называемых генных пустынях, что позволяет предположить, что могут существовать дополнительные механизмы. В настоящее время актуальность каждого механизма неизвестна. Также неизвестно распределение уровней воздействия на функцию белка — насколько обычны тонкие изменения функции генов по сравнению с серьезными изменениями? Наиболее понятными являются механизмы, возникающие из несинонимичных вариантов (бессмысленные и бессмысленные варианты с одним основанием, изменение аминокислоты в кодирующей области или усечение полипептидной цепи), которые могут изменять активность in vivo затронутого белка за счет воздействия на фолдинг и термодинамическая стабильность, связывание лиганда и партнера, катализ, аллостерическая регуляция и посттрансляционная модификация.В предыдущей работе мы разработали два метода машинного обучения для определения того, какие пропущенные варианты оказывают сильное влияние на функцию белка. Один из этих методов использует набор особенностей трехмерной структуры белка для идентификации тех вариантов, которые значительно снижают термодинамическую стабильность белка, и мы показали, что это основной механизм моногенного заболевания [4]. Второй метод использует степень сохранения локальной последовательности и характер аминокислотной замены для идентификации вариантов, которые влияют на функцию in vivo посредством любого миссенс-механизма [5].Эти методы были проверены путем анализа набора вариантов, вызывающих моногенное заболевание фенилкетонурии (Shi, Sellers & Moult, In press), и набора общих SNP, которые были исследованы экспериментально [6]. Применение этих методов для пропуска SNP в геноме человека показало, что примерно четверть из них оказывает сильное влияние на функцию белка in vivo , при этом снижение термодинамической стабильности белка снова играет главную роль [5]. Высокая частота этих высокоэффективных SNP предполагает, что они могут играть значительную роль в распространенном заболевании.Чтобы изучить эту возможность, мы применили эти методы к результатам GWAS из исследования семи распространенных заболеваний [1], проведенного консорциумом Wellcome Trust Case Control Consortium (WTCCC), и последующих исследований. Анализ показывает, что около одной трети всех локусов имеют по крайней мере один миссенс-SNP, который, по прогнозам, оказывает большое влияние на функцию белка, и они представляют возможные молекулярные механизмы для этих локусов. Эти результаты подтверждают важную роль несинонимичных SNP с высоким уровнем воздействия.

Здесь мы представляем экспериментальное исследование возможных молекулярных механизмов прогнозируемого высокоэффективного миссенс-SNP в макрофагностимулирующем белке (MSP, также известном как фактор роста гепатоцитов, подобный белку (HGF-подобный), связанный с локусом болезни Крона на хромосоме, связанным с заболеванием. 3.Этот SNP был ранее идентифицирован как связанный с воспалительным заболеванием кишечника в более сфокусированном геноцентрическом исследовании UC [7]. Недавно сообщалось, что тот же самый SNP связан с хроническим заболеванием печени, первичным склерозирующим холангитом, заболеванием, которым страдают 2,4–7,5% людей с воспалительным заболеванием кишечника [8].

Болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК) — хронические воспалительные заболевания кишечника с генетическим компонентом и относительно высокой наследуемостью, составляющей 50–60% [9].Серии GWAS и meta GWAS к настоящему времени идентифицировали 71 и 47 локусов восприимчивости для CD и UC, соответственно [2], [10]. Гены в этих локусах охватывают широко распределенные функции, но некоторые из них участвуют в воспалительной реакции и, в частности, в аутофагии. Как описано ниже, анализ локуса на хромосоме 3, впервые идентифицированный в исследовании GWA [1], идентифицирует один высокоэффективный несинонимичный SNP в гене MST1, что приводит к замене Arg689 на Cys в β-цепи MSP.

MSP является компонентом сигнального пути, который регулирует аспекты врожденного иммунного ответа на инфекцию и клеточный стресс.MSP и его рецептор, тирозинкиназа рецептора RON, участвуют в хемотаксисе и активации макрофагов. Функция макрофагов в нормальной клеточной пролиферации, адгезии, подвижности и апоптозе хорошо документирована, а их активность повышена во многих солидных опухолях. Такая повышенная активность коррелирует с метастазированием и плохим прогнозом рака. Следовательно, сигнальные пути MSP / RON были предложены в качестве потенциальной терапевтической мишени для лечения рака [11].

MSP — это сывороточный белок, который циркулирует в крови как неактивный одноцепочечный предшественник (про-MSP), состоящий из двух цепей, α и β [12].Расщепление пептидной связи Arg483-Val484 дает зрелый активный гетеродимер MSP α / β, связанный дисульфидной связью между Cys468 и Cys588. Α-цепь (MSPα) содержит четыре крингл-домена, а β-цепь (MSPβ) принимает трипсин-подобную сериновую протеазную складку, но не обладает каталитической триадой и протеолитической активностью. Матриптаза-1, трансмембранная сериновая протеаза типа II, экспрессируемая на эпителиальных клетках и макрофагах, специфически расщепляет и активирует про-MSP [13].

Зрелая форма RON содержит две цепи (α и β), связанные дисульфидной связью.Α-цепь полностью внеклеточная и кодирует N-концевую половину домена Sema, домена, уникального для подсемейства RON / MET рецепторных тирозинкиназ. Β-цепь включает внеклеточную полипептидную область, которая включает С-концевую половину домена Sema, домен PSI (акроним для плексина, семафоринов, интегринов) и четыре иммуноглобулиноподобных домена, от IPT ₁ до IPT ₄. Один трансмембранный сегмент, за которым следует внутриклеточный домен тирозинкиназы, завершает β-цепь.Генное исследование показало, что два несинонимичных SNP (R523Q и G1335R) RON связаны с повышенным риском CD и UC [14].

Несколько исследований установили, что MSPβ связывается с доменом RON Sema с высокой аффинностью [15], [16], [17], [18]. Конкурентные эксперименты ELISA показали, что MSPα слабо связывается с RON Sema-PSI [18], тогда как конкурентные эксперименты с радиоактивно меченным MSP ¹²⁵ I показали, что MSPα не связывается с RON в интактных клетках [17], а анализы коиммунопреципитации не выявили связывания MSPα. к конструкции RON, которая содержала Sema-PSI и часть последующего IPT ₁ [19].Для сравнения, α- и β-цепи гомолога MSP, HGF, демонстрируют обратную тенденцию в аффинности связывания с рецептором HGF, MET, который является гомологом RON [20]. Предложенная трехмерная модель, основанная на комбинированном исследовании малоуглового рентгеновского рассеяния и криоэлектронной томографии, предполагает взаимодействие как α-, так и β-цепей HGF с доменом MET Sema [21]. По аналогии, возможно, что как α, так и β цепи MSP взаимодействуют с RON Sema, даже если связывание MSPα является слабым.

Результаты и обсуждение

Анализ SNP-кандидата

Первоначальное исследование WTCCC GWA [1] выявило девять локусов, в которых SNP-метки значимо связаны с повышенным риском болезни Крона.Один из них находится на хромосоме 3 и содержит три маркерных SNP. Два из этих маркеров находятся в интронах фагота (пресинаптический белок цитоматрикса, BSN, а третий является синонимом SNP в этом гене. Область неравновесного сцепления для локуса хромосомы 3 в 3p21 охватывает 20 генов, что является необычно большим числом. Анализ пенетрантности находит в общей сложности 148 SNP-кандидатов, семь из которых не являются синонимичными (Таблица 1).

Все несинонимичные SNP, кроме двух, имеют высокую степень достоверности, присвоения на основе профиля низкого воздействия на функцию in vivo .Нет возможности присвоения A741T в BSN, но этот ген маловероятный кандидат с биологической точки зрения, поскольку он участвует в развитии нейронов и экспрессируется только в головном мозге. Единственное назначение с высокой достоверностью и высоким воздействием — для rs3197999 в MST1, что приводит к замене аргинина на цистеин в положении 689 MSP. Этот SNP находится в почти полном LD с маркером (R ² = 0,95). Анализ профиля последовательности классифицирует эту замену как сильное влияние на функцию белка с высокой достоверностью оценки машины опорных векторов (SVM) (-1.13), что в первую очередь определяется тем фактом, что все близкие ортологи имеют аргинин в этом положении, а ни один гомолог не имеет цистеина. Напротив, структурный метод классифицирует изменение как доброкачественное (оценка SVM с высоким уровнем достоверности 0,52). Таким образом, первоначальный вычислительный анализ предполагает, что этот SNP является единственным известным высокоэффективным несинонимичным кандидатом в локусе хромосомы 3 и влияет на функцию MSP in vivo посредством некоторого механизма, не связанного со стабильностью белка. Замена MSP R689C находится на поверхности β-цепи MSP [22].Результаты вычислений могут отражать роль этого остатка в ряде процессов, которые могут быть нарушены аминокислотной заменой и, таким образом, способствовать восприимчивости к болезни Крона. Основными среди них являются снижение аффинности связывания с RON Sema, структурные нарушения, возникающие в результате неправильной дисульфидной связи, образованной с вновь введенным цистеином, или нарушение активации про-MSP матриптазой-1. Чтобы изучить вклад этих эффектов, мы предприняли попытку охарактеризовать MSPβ и его взаимодействие с конструкциями внеклеточного домена RON in vitro с использованием хорошо очищенных белков.Хотя вычислительный анализ классифицировал замену как не влияющую на стабильность белка, и расположение поверхности подтвердило этот анализ, мы, тем не менее, также измерили изменение стабильности белка в результате замены, чтобы напрямую определить любой вклад этого фактора.

Термостабильность MSPβ

DSF — полезный метод для быстрой оценки термостабильности белков. При таком подходе белки подвергаются постепенному повышению температуры, и разница между температурами плавления (T _m) двух сравниваемых образцов измеряется с использованием флуоресцентного красителя (в данном исследовании использовался SYPRO Orange), эмиссионные свойства которого изменяются. при взаимодействии с развернутым белком.MSPβ имеет единственный сайт гликозилирования и продуцировался в клетках Drosophilae melanogaster Schneider 2 (S2), которые могут давать паттерн гликозилирования, отличный от того, который продуцируется в клетках человека, и, следовательно, различную стабильность белка. Чтобы определить, остается ли тенденция изменения термостабильности R689C дикого типа и MSPβ R689C такой же при изменении гликозилирования, белки были дегликозилированы, и их термостабильность была исследована в дополнение к стабильности гликозилированных белков (рис.1). Значения T _m (средняя точка кривых плавления) рассчитывались как максимум первой производной кривой плавления (рис. 1 А).

Рис. 1. Термостабильность MSPβ, контролируемая DSF.

Показаны четыре репрезентативных эксперимента, по одному для каждого MSPβ: гликозилированный дикого типа, дегликозилированный дикого типа, гликозилированный R689C и дегликозилированный R689C. Кривые плавления измеряли при нагревании образцов со скоростью 2 ° C в минуту (B). Значения T _m были рассчитаны как максимум первой производной кривых плавления (A).Значения первой производной (dF / dT) нормализованы и даны в%, где 100% соответствует наивысшему пику всего набора экспериментов. Значения флуоресценции даны по произвольной шкале (AU). В таблице 2 приведены значения T _м. Вариант R689C плавится при температуре примерно на 2,5 К ниже, чем температура дикого типа для дегликозилированного белка и на 1,6 К ниже для гликозилированной формы.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0027269.g001

Кривые плавления гликозилированных белков показывают явное снижение значения T _m мутантного белка по сравнению с MSPβ дикого типа (ΔT _м = 1.6 К, таблица 2). Статус гликозилирования MSPβ сильно влияет на термостабильность белка. Кривые плавления как дегликозилированного MSP дикого типа, так и R689C MSPβ показывают поразительное снижение значений T _m по сравнению с их гликозилированными аналогами (ΔT _m = 3,8 K для дикого типа и 4,7 K для R689C MSPβ, таблица 1). Дестабилизирующий эффект мутации R689C более выражен с дегликозилированными MSPβ (ΔT _m = 2,5 K), чем с гликозилированными белками.

Вместе данные DSF показывают, что MSPβ R689C дестабилизирован по сравнению с MSPβ дикого типа. Однако снижение стабильности, вероятно, слишком мало, чтобы оказывать значительное влияние на функцию белка in vivo . Анализ данных для белков, для которых доступны данные как ΔT _m, так и ΔΔG, таких как барназа [23], субтилизин [24], крингл-домен активатора плазминогена [25] и лизоцим Т4 [26], показывает 1 ккал / моль ⁻¹ изменение разности свободной энергии между свернутым и развернутым состояниями обычно соответствует изменению температуры плавления на 3–4 К.Исходя из этого, для гликозилированного MSP дестабилизация, вероятно, находится в диапазоне от 0,5 до 0,8 ккал-моль ^-1. В отличие от этого, мутации, вызывающие моногенное заболевание, которые действуют в соответствии с дестабилизацией, обычно имеют потерю стабильности, по крайней мере, на 2–3 ккал / моль ^-1 [4]. Простейшая модель взаимосвязи между потерей стабильности и более низкой эффективной активностью белка in vivo через повышенную концентрацию развернутых видов поддерживает экспоненциальную зависимость между степенью дестабилизации и ожидаемым изменением концентрации развернутого белка, так что в то время как типичный Мутация, вызывающая моногенное заболевание, увеличивает концентрацию развернутого белка примерно в 100 раз, дестабилизация в результате этого SNP, как ожидается, вызовет увеличение примерно в 3 раза.Тем не менее, вариант MSP может по-прежнему оказывать умеренное влияние на концентрацию in vivo белка in vivo.

R689C Назначение свободного цистеина MSPβ

Как объяснено в разделе «Методы», для идентификации свободных цистеинов в MSPβ R689C использовалась TPS-хроматография в сочетании с расщеплением трипсином и масс-спектрометрическим анализом. Рекомбинантный MSPβ был сконструирован в соответствии со стратегией, использованной для определения кристаллической структуры, включая 19 аминокислот линкера α-цепи, чтобы обеспечить образование пяти физиологически релевантных дисульфидных связей: Cys468-Cys588, Cys507-Cys523, Cys527-Cys562. , Cys602-Cys667, Cys657-Cys685.Другой цистеин, Cys672, расположен в непосредственной близости от дисульфидной связи Cys468-Cys588, соединяющей α- и β-цепи. Чтобы избежать аберрантной дисульфидной связи, Cys672 был мутирован в Ser. Таким образом, если все дисульфидные связи сформированы правильно в мутанте R689C MSPβ, будет обнаружен только пептид, который включает Cys689. Трипсин расщепляет пептиды в первую очередь по остаткам аргинина. Пептидная последовательность, фланкированная аргинином, которая охватывает Cys689, имеет следующий вид: Arg687-Ser688-Cys689-Trp690-Pro691-Ala692-Val793-Phe694-Thr-695-Arg696.Только один основной пептид R689C MSPβ был элюирован из колонки TPS. Пептид секвенировали с помощью масс-спектрометрии как: Ser-Cys-Trp-Ala-Val-Phe-Thr-Arg, подтверждая, что Cys689 не образовывал аберрантную дисульфидную связь. Таким образом, нет никаких доказательств неправильной внутримолекулярной дисульфидной связи.

Анализ взаимодействия MSPβ-RON с помощью SPR

Связывание дикого типа и R689C MSPβ (включая 19 аминокислот α-цепи MSP) с четырьмя иммобилизованными внеклеточными вариантами RON измеряли с помощью поверхностного плазменного резонанса (SPR).Данные SPR дополняют предыдущие исследования коиммунопреципитации, которые пришли к выводу, что MSPβ связывается с доменом RON Sema [18]. Кроме того, в настоящем исследовании определены значения K _d в экспериментальных условиях SPR как для дикого типа, так и для мутантного MSPβ. Типичные сенсограммы связывания показаны на фиг. 2. Кривые показывают, что MSP как дикого типа, так и R689C связываются с RON Sema, Sema-PSI, Sema-PSI-IPT ₁ и Sema-PSI-IPT _1–4. Кривые связывания в целом подгоняли к кинетической модели Ленгмюра 1-1 (таблица 3), что дает в 10-13 раз более плотное связывание для MSPβ дикого типа (13.5–21,2 нМ) по сравнению с мутантным MSPβ (148–233 нМ). Поскольку скорости связывания включения и выключения были довольно высокими, значения K _d также были рассчитаны с использованием модели равновесия (фиг. 3). В соответствии с кинетической моделью, модель равновесия давала в 7-8 раз более плотное связывание для MSPβ дикого типа (16,4–32,0 нМ) по сравнению с MSPβ R689C (139–244 нМ). Кроме того, данные по связыванию показывают, что белок-белковое взаимодействие может быть отнесено прежде всего к одному домену RON Sema без значительного вклада PSI и четырех доменов IPT, что согласуется с сообщаемым 90% -ным ингибированием связывания MSPβ с иммобилизованным полноразмерным RON от Sema или Sema-PSI с использованием конкурентных экспериментов ELISA [18].

Рисунок 2. Сенсограммы связывания MSPβ дикого типа и R689Cβ с иммобилизованными конструкциями внеклеточного домена RON.

Кривые связывания на каждой сенсограмме соответствуют возрастающим концентрациям аналита при 2-кратных стадиях разбавления: 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 и 512 нМ. Восемь экспериментов соответствуют иммобилизованным: (A, E) RON Sema. (B, F) РОН Сема-ПСИ. (C, G) RON Sema-PSI-IPT ₁. (D, H) RON Sema-PSI-IPT _1–4. Единицы ответа (RU) корректировали на неспецифическое связывание относительно поверхности пустой проточной кюветы.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0027269.g002

Сродство связывания SPR MSPβ / RON примерно в 100 раз выше, чем у гомологичного MET Sema-PSI и HGFβ, как измерено с использованием того же метода SPR. [27]. Напротив, исследования MET Sema-PSI SPR показали, что аффинность связывания с конструкцией HGFα в 10 раз выше, чем с HGFβ. Об аналогичном исследовании SPR связывания MSPα с доменами RON не сообщалось; однако исследования ELISA показали, что сродство связывания MSPα с RON более чем в 50 раз слабее, чем сродство MSPβ [15].Очевидный низкий вклад MSPα в связывание RON означает, что 10-кратное снижение аффинности связывания RON MSPβ R689C не может быть замаскировано взаимодействием RON / MSPα.

Для дальнейшего изучения взаимодействия RON / MSPβ, в конкурентных экспериментах SPR [28] измеряли захват мономерного MSPβ из предварительно уравновешенных смесей аналитов Sema / MSPβ и Sema-PSI-IPT _1–4 / MSPβ в иммобилизованных RON Sema-PSI- IPT _1–4 (рис. 4). Результаты подтвердили, что домен Sema сам по себе конкурирует с RON Sema-PSI-IPT _1–4 за связывание MSPβ.Рассчитанные константы диссоциации для дикого типа и R689C MSPβ (таблица 3) согласовывались с рассчитанными из экспериментов прямого связывания SPR (таблица 3).

Рисунок 4. Конкуренция SPR.

(A – D) Связывание с иммобилизованным RON-Sema-PSI-IPT ₄ смесей, содержащих MSPβ с различными концентрациями RON-Sema или RON-Sema-PSI-IPT ₄. (E – H) Зависимость концентрации свободного MSPβ от концентрации RON в смесях растворов. Концентрации свободного MSPβ определяли по измеренному относительному отклику на основании калибровочной кривой.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0027269.g004

В совокупности эксперименты по связыванию SPR показывают, что R689C MSPβ проявляет примерно в 10 раз меньшую аффинность связывания со своим рецептором по сравнению с MSPβ дикого типа. Пониженное сродство может нарушить биологическую функцию сигнальной системы MSP / RON.

Структурные последствия мутации R689C

Кристаллическая структура MSPβ показывает, что Arg689 расположен на поверхностной петле, полностью подверженной действию растворителя [22].Однако связанная с симметрией молекула упаковывается в кристаллы близко к Arg689, так что боковая цепь Arg689 укладывается против боковой цепи Trp593 на соседней молекуле, создавая энергетически выгодное π-π взаимодействие, которое способствует стабильности кристалла. MSPβ существует в растворе в виде мономеров, поэтому такое межмолекулярное взаимодействие маловероятно. Вместо этого структура показывает, что ориентация боковой цепи Arg689 может легко регулироваться с образованием внутримолекулярного солевого мостика между боковыми цепями Arg689 и Glu648 и одновременно образовывать водородную связь между группой гуанидиния и карбонилом основной цепи Gly649 (рис.5). И Glu648, и Gly649 находятся в петле, смежной с петлей Arg689, таким образом, эти взаимодействия могут способствовать стабильности белка. Напротив, цистеин в положении 689 не может образовывать аналогичные взаимодействия, что может объяснить умеренное снижение стабильности белка, связанное с R689C MSPβ.

Рис. 5. Конформация боковой цепи Arg689 в кристалле MSPβ и смоделированных структурах.

В кристаллической структуре (желтый) боковая цепь участвует в межмолекулярных контактах кристаллов, а в моделируемой конформации (голубой) она образует внутримолекулярный солевой мостик с Glu648 и водородную связь с карбонилом основной цепи Gly649.Эти взаимодействия, если они присутствуют или частично присутствуют в растворе, могут способствовать умеренному изменению стабильности белков, вызванному заменой R689C.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0027269.g005

Модель комплекса MSPβ / RON-Sema была создана с использованием структур отдельных белков, наложенных на HGFβ / MET-Sema [29] , как описано в разделе о методах. Эта модель помещает Arg689 вне границы раздела белок-белок, при этом группа гуанидиния находится на расстоянии минимум 11 Å от карбоксилата Glu149 на RON Sema, ближайшем остатке на рецепторе (рис.6). Основываясь на модели, замены в этом положении вряд ли повлияют на сродство белок-белок. Тем не менее, исследования SPR показали, что R689C MSPβ проявляет приблизительно 10-кратное снижение сродства к конструкциям RON по сравнению с MSPβ дикого типа.

Рисунок 6. Модель структуры комплекса MSPβ / RON Sema.

Arg689 и расположение сайта расщепления α / β выделены пурпурным цветом. Молекулярные поверхности показаны прозрачными цветами. Модель была построена путем наложения кристаллических структур MSPβ [22] (запись PDB 1ASU) и RON-Sema-PSI (Chao and Herzberg, неопубликовано) на кристаллическую структуру комплекса HGFβ / MET-Sema-PSI [29] (Запись PDB 1SHY).В этой модели Arg689 не участвует напрямую в интерфейсе RON / MSP.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0027269.g006

Исследование сайт-направленного мутагенеза другого варианта MSP, R683Q, не обнаружило связывания MSP / RON [15]. Модель MSPβ / RON-Sema помещает Arg683 на интерфейс белок-белок по аналогии с Arg695 HGFβ. Однако, в то время как HGF Arg695 взаимодействует с остатком тирозина MET (Tyr125), тирозиновым аналогом на RON является остаток аланина (Ala128), который не может участвовать в гуанидин-ароматическом взаимодействии.В самом деле, многие из интерфейсных остатков не консервативны между MET Sema и Ron Sema или между HGFβ и MSPβ, что согласуется с взаимной исключительностью специфичности пар RON / MSP и MET / HGF [30]. В совокупности исследования связывания SPR и информация о мутагенезе подтверждают мнение о том, что интерфейсы белок-белок двух систем похожи, но не идентичны друг другу. Следовательно, точное картирование взаимосвязи между сайтом мутации Arg689 и интерфейсом MSPβ / RON Sema требует определения структуры комплекса MSPβ / RON Sema.

Активация MSP

Внеклеточный домен сериновой протеазы макрофагальной трансмембранной протеазы, матриптазы-1, активирует про-MSP [13] путем специфического расщепления одиночной полипептидной цепи α-β между Arg483 и Val484 с образованием α- и β-цепей, связанных одним дисульфидом. связь между Cys468 и Cys588. Пептид Arg483-Val484 был расщеплен в кристаллической структуре, и Val484 похоронен в ядре белка. Поскольку точное положение пептида Arg483-Val484 на поверхности белка до расщепления неизвестно, соседний Gly486, расположенный на поверхности MSPβ, также выделен на рисунке 6.Это показывает, что Arg689 расположен удаленно от сайта активации, и, таким образом, замена цистеином вряд ли непосредственно нарушит расщепление пептидной связи. Тем не менее, временный интерфейс MSP / матриптаза, образующийся во время протеолиза, может охватывать большую площадь поверхности и вовлекать Arg689, так что замена R689C может мешать этому взаимодействию и нарушать активацию MSP. Поэтому мы исследовали расщепление матриптазой-1 как дикого типа, так и мутантного MSPβ, оба из которых содержат слитую 19 C-концевую аминокислоту MSPα.Расщепленные и нерасщепленные белки перемещаются на одинаковое расстояние в геле SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях. Напротив, анализ SDS-PAGE в восстанавливающих условиях разрывает дисульфидные связи и различает нерасщепленную β-цепь и более короткую расщепленную β-цепь, в которой теперь отсутствует аминокислотный фрагмент MSPα 19. Эксперимент показывает, что инкубация вариантов MSPβ дикого типа и R689Cβ с матриптазой-1, как описано в разделе о методах, с последующим анализом SDS-PAGE в восстанавливающих условиях дает расщепленные белки дикого типа и мутантные белки (рис.7). Таким образом, замена не мешает активации MSP.

Фигура 7. MSPβ SDS-PAGE, выполняемый в восстанавливающих условиях для оценки расщепления матриптазой-1.

Применяли образцы MSPβ, слитых с 19 C-концевыми аминокислотами MSPα, до и после 4 часов инкубации с матриптазой-1 при 37 ° C. Дорожка 1 — MSPβ дикого типа; Дорожка 2 — MSPβ дикого типа после инкубации с матриптазой-1; Дорожка 3 — R689C MSPβ; Дорожка 4 — R689C MSPβ после инкубации с матриптазой-1; М — маркеры молекулярной массы.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0027269.g007

Образование дисульфидных мостиков и внутримолекулярные взаимодействия

Наконец, есть два других возможных последствия мутации R689C. Во-первых, поскольку MSP является внеклеточным белком, свободный цистеин может образовывать межмолекулярную дисульфидную связь с образованием димеров MSP, которые могут мешать связыванию с RON. SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях образца, который хранился при 4 ° C в течение более шести месяцев, выявил небольшие количества димеров MSPβ.Этот димерный белок очищали гель-фильтрационной хроматографией, и его термостабильность была на 1,5 К ниже, чем у мономерного MSPβ R689C (T _m = 68,7 ° C). Аффинность связывания димерного MSPβ с конструкциями RON не была нарушена и фактически была сопоставима с таковой MSPβ дикого типа ( K _d = 3,7–4,9 нМ), возможно, из-за эффектов авидности. Исследование присутствия димеров MSP у лиц, несущих мутацию R689C, необходимо для определения, играет ли димеризация роль in vivo .Тем не менее, эти результаты предполагают, что даже если бы образовались димеры, связывание RON не было бы нарушено.

Во-вторых, остается неизвестным, взаимодействует ли MSPβ тесно с каким-либо из доменов α-цепи и какой из доменов MSP обеспечивает физиологическую димеризацию RON. Если Arg689 играет роль в таких взаимодействиях, мутация R689C может отрицательно влиять на функцию. Чтобы пролить свет на эти вопросы, потребуются исследования всего активированного MSP, содержащего как α-, так и β-цепи, и его влияние на димеризацию RON.Ясно, что клеточная система более сложна, чем исследованная in vitro ; тем не менее, различные свойства мутантного MSPβ по сравнению с MSPβ дикого типа значительны и могут вносить вклад в нарушение биологической функции.

Выводы

Вычислительный анализ результатов GWAS для локуса хромосомы 3, ассоциированного с болезнью Крона, идентифицирует SNP, приводящий к замене аминокислоты MSPβ R689C, как единственного известного жизнеспособного миссенс-кандидата для участия в механизме заболевания в локусе.Анализ вычислительного воздействия свидетельствует о том, что ожидается, что R689C будет оказывать существенное влияние на функцию in vivo белка посредством некоторого механизма, отличного от термодинамической дестабилизации. Дальнейшая поддержка участия этого SNP исходит из его ассоциации с риском заболевания в целевом исследовании генов [7]. Сами по себе эти результаты дают убедительные доказательства роли SNP в заболевании, но замена может иметь незначительный эффект на функцию in vivo ; или в этом локусе может быть задействован механизм, отличный от missense, такой как влияние на экспрессию или трансляцию; или может быть ответственен неизвестный генетический вариант LD с маркером.Был изучен ряд возможных функциональных воздействий на уровне белка. Результаты показывают, что замещение не приводит к образованию ненативной дисульфидной связи или нарушению активации матриптазой-1. Также наблюдается умеренное снижение стабильности белка, которое может играть второстепенную роль. Основным открытием является то, что замена снижает аффинность связывания с тирозинкиназой рецептора RON на величину, которая может серьезно повлиять на передачу сигналов: если предположить, что in vivo концентрации RON и MSP значительно ниже K _d значения комплекса, более низкое сродство приведет к на порядок более низкой концентрации сигнального комплекса, вероятно, существенно уменьшив нормальную функцию сигнального пути MSP / RON.Это, в свою очередь, может изменить воспалительную реакцию, особенно уровень активности макрофагов. Некоторые пациенты с болезнью Крона демонстрируют более низкий, чем обычно, ответ макрофагов, что дает дополнительные косвенные доказательства существования такого механизма.

Материалы и методы

Идентификация несинонимичных SNP-кандидатов

Как отмечалось ранее, ассоциативные исследования выявляют те SNP, включенные в микрочип (tag SNP), которые связаны с повышенным риском заболевания.Маркер сам может быть вовлечен в механизм заболевания или, что более вероятно, находится в LD с одним или несколькими SNP механизма. Таким образом, учитывая набор маркерных SNP в локусе восприимчивости, нам необходим набор возможных механизмов-кандидатов. Наличие данных о неравновесии по сцеплению в Hapmap [31] обеспечивает основу для получения такого списка. Общий подход состоит в том, чтобы извлечь все SNP в сильном LD с одним или несколькими маркерами в локусе из информации Hapmap LD. Этот метод исключает жизнеспособных кандидатов, менее сильно связанных с маркерами.Более строгий подход состоит в том, чтобы вменять вероятные генотипы у каждого человека в исследовании для каждого SNP Hapmap, не включенного в микроматрицу [32]. Поскольку генотипы SNP в слабой LD с маркерами нельзя точно рассчитать, результирующая вероятность изменения частоты SNP недооценена. Вменение также требует, чтобы в исследование были включены полные данные о лицах, что не всегда легко получить. Мы представили альтернативный подход, разработанный для того, чтобы его можно было легко применить к любому набору данных и создать всеобъемлющий набор кандидатов.Метод выбирает в качестве кандидатов все SNP, для которых пенетрантность (вероятность наличия заболевания при наличии определенного SNP) такая же или выше, чем у маркерных SNP в локусе. То есть: где P (D | c) — это вероятность того, что у человека есть заболевание, при условии, что он несет аллель-кандидат ‘c’, а P (D | m) — это вероятность того, что человек имеет заболевание, учитывая, что он является носителем маркерный аллель. Проникновение рассчитывается на основе данных Hapmap [31] и частот популяции маркера и SNP-кандидатов.Кроме того, включен любой SNP, для которого корреляция неравновесия по сцеплению r ²> = 0,8.

Идентификация высокоэффективных несинонимичных SNP-кандидатов

Идентификация SNP, которые существенно дестабилизируют складчатую структуру белковой молекулы [4]. Набор структурных эффектов, таких как уменьшение гидрофобной площади, чрезмерная упаковка, деформация скелета и потеря электростатических взаимодействий, используется для представления влияния мутаций одного остатка на стабильность белка.SVM был обучен на наборе мутаций, вызывающих моногенное заболевание (извлеченных из ранней версии базы данных мутаций генов человека [33]), и на контрольном наборе не вызывающих заболевание мутаций. При тестировании с помощью сложного ножа этот метод выявляет 74% мутаций болезни с 15% ложноположительных результатов. Уровень очевидных ложноотрицательных результатов включает как истинные ложноотрицательные результаты (случаи, когда речь идет о стабильности, а классификация метода неверна), так и случаи, когда вклад в заболевание возникает из-за какого-либо фактора, кроме стабильности.Когда включены только присвоения с более высокой степенью достоверности (те, у которых оценка SVM <-0,5), частота ложных срабатываний составляет 11%. Использование этого метода для оценки набора данных мутагенеза in vitro с помощью SVM установило, что большинство мутаций, связанных с моногенными заболеваниями, влияют на стабильность белка на 1-3 ккал / моль ^-1 [4].

Идентификация высокоэффективных SNP через свойства консервации аминокислотной последовательности: Рассмотрены степень консервативности семейной последовательности и типы остатков, наблюдаемых в несинонимичном положении SNP.Чем более ограничена аминокислота, тем более вероятно, что другой или необычный остаток в этом положении будет вредным для функции белка. SVM также используется для идентификации высокоэффективных замен в этой модели с использованием тех же наборов данных о заболеваниях и контролях, что и для метода стабильности. При тестировании методом складного ножа этот метод выявляет 80% мутаций болезни с ложноположительной частотой 10% (для присвоений с высокой степенью достоверности, соответственно, 16% и 6% ложноотрицательных и ложноположительных результатов). Преимущество этого метода состоит в том, что он не требует знания структуры и поэтому может применяться к большей части SNP.Его недостаток состоит в том, что он не дает прямого представления о природе воздействия на функцию белка. (Полное описание см. В [5]).

Производство и очистка рекомбинантных конструкций внеклеточного домена RON

Внеклеточная область гена MST1R человека была амплифицирована из клона pMSCVneo-hRON-2HA (любезно предоставлена доктором Памелой А. Хэнки, Университет штата Пенсильвания) и лигирована в pMT / BiP / V5-HisA, расщепленную BglII / AgeI. вектор для секретируемой экспрессии в виде С-концевого нерасщепляемого рекомбинантного белка с меткой His ₆ в клетках Drosophilae melanogaster Schneider 2 (S2) (Drosophila Expression System, Invitrogen).Предполагаемый сайт расщепления фурином в сема-домене RON (Lys305-Arg306-Arg307-Arg308-Arg309-Gly310-Ala311) был мутирован на тромбин (Lys305-Leu306-Val307-Pro308-Arg309-Gly310-Ser311) (протеаза TEV Glu304-Lys305-Arg306-Tyr307-Arg308-Gln309-Gly310) сайт расщепления. Рекомбинантные белки содержат два остатка (Arg23 и Ser24) на N-конце и восемь аминокислот (Thr684, Gly685 и His686-His691) на C-конце, полученных из вектора экспрессии. Были сконструированы четыре различных конструкции RON: Sema (Glu25-Gly524), Sema-PSI (Glu25-Pro568), Sema-PSI-IPT ₁ (Glu25-Glu683) и Sema-PSI-IPT _1–4 (Glu25 -Ser956).Последовательности всех экспрессионных клонов подтверждали секвенированием ДНК.

Drosophilae melanogaster S2 клетки трансфицировали векторами экспрессии RON и pCoPuro, и отбирали стабильные трансфектанты, устойчивые к пуромицину. Количество белка в кондиционированной бессывороточной среде (HyClone SFX) определяли с помощью вестерн-блоттинга с использованием моноклонального антитела Penta-His (Qiagen) и проводили клональный отбор стабильных трансфектантов для получения клонов с улучшенными уровнями экспрессии.Для крупномасштабной экспрессии стабильные клетки S2 выращивали во встряхиваемых колбах при 28 ° C, и экспрессию белка из промотора металлотионина индуцировали добавлением 0,6 мМ CuSO ₄. Клетки удаляли центрифугированием через ~ 4–5 дней после индукции, и кондиционированную среду без клеток наносили непосредственно на колонку Chelating Sparse Fast Flow, предварительно уравновешенную водой MilliQ (GE Health Sciences) [34]. Смолу промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором, а затем 0,5 М NaCl для удаления неспецифически связанных белков и загрязнений.Связанный белок элюировали 50 мМ трис-HCl, pH 8,0, содержащим 50-500 мМ имидазола, и фракционировали последовательно 45% и 80% сульфатом аммония. Элюированный белок очищали с помощью эксклюзионной хроматографии на Sephacryl S200 (GE Health Sciences) в 20 мМ Трис-HCl, pH 7,8, 0,10 М NaCl, 0,5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоте (ЭДТА). Очистка RON Sema-PSI-IPT1 _1–4 потребовала дополнительной стадии ионообменной хроматографии с использованием Source 30Q.

Чистоту и идентичность белка контролировали электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и вестерн-анализом с использованием моноклонального антитела Penta-His (Qiagen).Концентрация RON Sema, Sema-PSI, Sema-PSI-IPT ₁ и Sema-PSI-IPT1 _1–4 была определена с использованием коэффициентов экстинкции 27,235 M ^-1 см ^-1, 42,745 M ^-1 см ^-1, 44 485 M ^-1 см ^-1 и 67 695 M ^-1 см ^-1 соответственно. Выход белка на литр кондиционированной среды составлял ~ 1 мг, ~ 1,5 мг, ~ 2,5 мг и 0,2 мг соответственно. Эксклюзионная хроматография и многоугловое рассеяние света MiniDawn TREOS (Wyatt Technology) показали, что белок был мономерным.Спектрометрический анализ времени пролета с помощью лазерной десорбции с использованием матрицы (MALDI-TOF) рекомбинантных белков RON дал MW = 56 444 ± 313 Да для Sema (∼ Δ1957 Да больше, чем расчетная MW = 54 487 Да), 64 039 ± 162 Да для Sema-PSI (на ∼Δ4710 Да больше, чем расчетная MW = 59329 Да), 77,689 ± 2 35 Да для Sema-PSI-IPT ₁ (на ∼Δ5789 Да больше, чем расчетная MW = 71 908 Да) и 108 971 ± 366 Да для IPT1 _1–4. (∼Δ8308 Да больше, чем расчетная MW = 100 663 Да). Более высокие молекулярные массы объясняются посттрансляционными модификациями.Веб-сервер NetNGlyc предсказывает 8 потенциальных сайтов N-гликозилирования для аминокислотной последовательности Asn-Xaa-Ser / Thr, четыре в домене Sema и по одному в каждом домене IPT (http://www.cbs.dtu.dk/services/ NetNGlyc /).

Получение и очистка рекомбинантных MSPβ дикого типа и R689C

Рекомбинантный человеческий MSPβ был получен из кДНК MSP (ID клона: 51, Open Biosystems) в соответствии со стратегией дизайна, использованной для продукции белка, которая дала кристаллическую структуру [22], за исключением того, что белок для текущего исследования продуцировался в клетках S2. .Рекомбинантный MSPβ клонировали в сайты AvaI / PmeI вектора pMT / BiP / V5-HisC (Invitrogen). Он включает соседние N-концевые 19 аминокислотных остатков α-цепи (остатки Phe465-Gly711). Cys672 был мутирован в серин (Quick Change ™ _, Stratagene) для предотвращения образования неправильной дисульфидной связи из-за неспаренного Cys672, который расположен рядом с двумя другими остатками цистеина, которые образуют дисульфидную связь [22]. Этот вариант будет называться белком дикого типа. Также была сконструирована мутация R689C, связанная с CD и UC.Конструкции MSPβ дикого типа и мутантные конструкции подтверждали секвенированием ДНК.

клетки S2 Drosophila (Invitrogen) трансфицировали векторами экспрессии MSPβ дикого типа или R689C и pCoBlast, и отбирали стабильные трансфектанты, устойчивые к бластицидину. Для продукции белка стабильные трансфектанты выращивали в среде SFX с добавлением 20 мМ L-глутамина. Экспрессию белка индуцировали 0,5 мМ CuSO4. Клетки удаляли центрифугированием через 4 дня после индукции. Кондиционированную среду последовательно пропускали через смолы Chelex 100 (BioRad) и QSepharose FF (GE Health Sciences) для удаления Cu ²⁺, ДНК и некоторых загрязняющих белков.Проточную фракцию QSepharose концентрировали с помощью концентратора QuixStand Cross (Amersham Biosciences) и наносили на смолу с хелатированной сефарозой Talon Co ²⁺ (Clontech), уравновешенную 50 мМ фосфатом калия (pH 7,5), 0,5 M NaCl и 10 мМ имидазол. Меченный His MSPβ элюировали указанным выше буфером, содержащим 150 мМ имидазола, и дополнительно очищали на колонке Superdex 200 HR (GE Health Sciences), уравновешенной 10 мМ трис-HCl (pH 8,0) и 100 мМ NaCl. Эксклюзионная хроматография и многоугловое рассеяние света показали, что белок существует в растворе в виде мономеров.

Концентрации белка определяли с использованием коэффициента молярной экстинкции при 280 нм, равного 50 920 M ^-1 см ^-1. Очистка дала ~ 2 мг MSPβ из 1 литра кондиционированной среды. Спектрометрический анализ MALDI-TOF рекомбинантных белков дикого типа и R689C MSPβ дал MW = 29,260 ± 33 Да (∼ Δ916 Да больше, чем расчетная MW = 28344) и 29370 ± 42 Да (∼Δ1096 Da больше, чем расчетная MW = 28274). , соответственно. MSPβ имеет единственный потенциальный сайт N-гликозилирования в Asn615.Таким образом, разница в молекулярной массе согласуется с посттрансляционной модификацией в единственном сайте гликозилирования, содержащем 6-7 сахарных единиц.

Как дикого типа, так и мутантный MSPβ обрабатывали гликоамидазой PNGase F для удаления N-гликозильной группы. Рекомбинантная PNGase F из Elizabethkingia miricola (ATTC 33958D) была произведена в доме, как описано ранее [35]. Раствор, содержащий MSPβ и PNGase F в соотношении 100-1 в 50 мМ калий-фосфатном буфере (pH 7.5) инкубировали 3 ч при 37 ° C. Дегликозилированный MSPβ очищали эксклюзионной хроматографией на колонке Superdex 200 HR в 20 мМ буфере MES (pH 6,0) и 100 мМ NaCl. Анализы MALDI-TOF дали MW = 28 260 ± 18 Да и MW = 28 362 ± 22 Да для дикого типа и R689C MSPβ соответственно, что соответствует теоретической молекулярной массе негликозилированных белков.

Дифференциальная сканирующая флуориметрия

Эксперименты DSF проводили с использованием системы количественной ПЦР в реальном времени (RT) Mastercycler ep realplex (Eppendorf, Гамбург, Германия).Образцы MSPβ подвергали нагреванию, как описано ранее [36]. Вкратце, исходные растворы белка (0,5 мг / мл) в 10 мМ Na ⁺ буфере HEPES (pH 7,3), 150 мМ NaCl смешивали со свежеразведенным Sypro Orange (10 ×) (Invitrogen, Пейсли, Шотландия, Великобритания) для получения создать 20 мкл реакционных растворов в 96-луночном планшете Fast Optical (Applied Biosystems). После герметизации планшета оптической клейкой пленкой (Applied Biosystems) и центрифугирования образец контролировали в приборе RT-PCR следующим образом.Протокол нагрева включал этап предварительного нагрева при 30 ° C в течение 120 с и последующий градиент нагрева от 30 до 90 ° C со скоростью 2 ° C / мин. Данные были собраны с использованием настроек детектирования калибровки красителя ROX (Applied Biosystems). Кривые плавления были получены для гликозилированной и дегликозилированной форм MSPβ дикого типа и R689C. Температуру плавления (Т _м) каждой кривой плавления вычисляли как максимум первой производной кривой. Среднее значение T _m каждого белка определяли по четырем отдельным кривым плавления.

Идентификация свободного цистеина в R689C MSPβ

Тиопропилсефароза 6B (TPS) реагирует с белками, содержащими свободные тиоловые группы, в невосстанавливающих условиях с образованием дисульфидных связей, что позволяет отделить пептиды, содержащие восстановленные тиоловые группы, от пептидов, содержащих дисульфидные связи. TPS-хроматография в сочетании с расщеплением трипсином и масс-спектрометрическим анализом идентифицировала свободный цистеин в MSPβ R689C следующим образом. MSPβ R689C, ковалентно связанный с гранулами TPS (GE Life Sciences) в 50 мМ NH ₄ HCO ₃ буфере (pH 7.7), обрабатывали трипсином (Sigma-Aldrich) при соотношении фермент / субстрат 1-25 (мас. / Мас.) В течение 40 мин при 37 ° C. После протеолиза гранулы TPS промывали буфером, содержащим 50 мМ NH ₄ HCO ₃ (pH 7,7) и 150 мМ NaCl для удаления неспецифически связанных фрагментов расщепления. Связанные пептиды элюировали из колонки в присутствии 10 мМ DTT. Элюированные фракции обрабатывали 50 мМ йодацетамида в течение 60 мин при комнатной температуре. Затем аликвоты малых фракций смешивали с равными объемами 10 мг / мл α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, растворенной в 50% ацетонитриле и 0.1% TFA и наносили на планшет-мишень ABI 01-192-6-AB. Масс-спектрометрический анализ (МС) выполняли с использованием анализатора протеомики AB4700 (Applied Biosystems, Фрамингем, Массачусетс, США). Регистрация в MS-режиме состояла из 1000 лазерных выстрелов, усредненных по 20 позициям образца. Для регистрации в MS / MS-режиме 3000 лазерных выстрелов усредняли по 30 позициям образца для фрагментов распада после источника. Автоматический комбинированный сбор данных МС и МС / МС контролировался с помощью программного обеспечения 4.0 Explorer серии 4000. Анализ данных проводился с помощью программного обеспечения GPS Explorer 3.5 с использованием Mascot 2.0 (MatrixScience, Лондон, Великобритания) в качестве поисковой системы. При поиске допуск по массе составлял 0,08 Да для ионов-предшественников и 0,2 Да для ионов-фрагментов. Из-за наличия мутации R689C анализ данных также выполняли вручную с использованием моноизотопных масс триптических пептидов, предсказанных для MSPβ R689C с помощью программного обеспечения PeptideMass (http://ca.expasy.org/tools/peptide-mass.html).

Поверхностный плазмонный резонанс

Связывание MSPβ дикого типа и R689Cβ с различными комбинациями внеклеточных доменов RON измеряли с использованием Biacore T100 (GE Health Sciences).Очищенные Sema, Sema-PSI, Sema-PSI-IPT ₁ и Sema-PSI-IPT ₄ были ковалентно связаны в случайной ориентации через их первичные аминогруппы с карбоксиметилированной декстрановой матрицей сенсорного чипа CM5 (серия S ; GE Health Sciences) согласно протоколу производителя. Все белки разводили до концентрации 15 мкг / мл в 10 мМ Na ⁺ ацетат (pH 4,0 для Sema и Sema-PSI или pH 5,0 для Sema-PSI-IPT ₁ и Sema-PSI-IPT _{1– 4}). Три варианта RON были иммобилизованы на трех проточных кюветах сенсорного чипа с объемной концентрацией матрицы 10–20 фМ.Для справки, четвертая проточная ячейка обрабатывалась только реагентами, активирующими поверхность N-гидроксисукцинимид / N- (3-диметиламинопропил) -N’-этилкарбодиимид (NHS / EDC). После иммобилизации белка поверхности чипа блокировали 1 М этаноламином (pH 8,5), а несвязанные белки удаляли промыванием 50 мМ NaOH. Для фиксации четырех вариантов RON требовалось два сенсорных чипа, поэтому два варианта были включены дважды. Один чип включал Sema, Sema-PSI-IPT ₁ и Sema-PSI-IPT _1–4, а второй чип включал Sema-PSI, Sema-PSI-IPT ₁ и Sema-PSI-IPT _1–4.

Анализы связывания проводили в рабочем буфере, содержащем 10 мМ Na ⁺ HEPES (pH 8,0), 150 мМ NaCl и 0,005% поверхностно-активного вещества P20 (GE Health Sciences) при 25 ° C. Для уменьшения неспецифического связывания иммобилизованные чипы уравновешивали рабочим буфером с добавлением 0,2 мг / мл бычьего сывороточного альбумина при скорости потока 10 мкл / мин в течение нескольких часов с последующим праймированием только рабочим буфером. Чтобы охарактеризовать кинетику связывания MSPβ дикого типа, концентрации белка в диапазоне от 5 до 500 нМ получали путем поэтапного разбавления и вводили на поверхности с RON в течение 2 мин при скорости потока 50 мкл / мин.После каждой инъекции следует 2-минутный период диссоциации. Для экспериментов с MSPβ R689C концентрации варьировались от 32 до 2000 нМ. Все инъекции выполнялись с помощью программы Wizard «Customized Application» в автоматическом режиме. В конце каждого цикла поверхности сенсорного чипа регенерировали путем 0,5-минутной инъекции 25 мМ NaOH с последующей 2-минутной промывкой текущим буфером.

Competition SPR эксперименты исследовали взаимодействие MSPβ / RON, следуя ранее опубликованному подходу [28].В экспериментах измеряли связывание свободного MSPβ (дикого типа и R689C) из предварительно уравновешенных смесей аналитов RON Sema / MSPβ или Sema-PSI-IPT _1–4 / MSPβ с ковалентно иммобилизованным Sema-PSI-IPT _{1– 4}. Концентрации MSPβ, близкие к расчетным значениям K _d (10 нМ для MSPβ дикого типа или 35–100 нМ для MSPβ R689C) смешивали с возрастающими концентрациями (0,1–10 000 нМ) Sema- или Sema-PSI-IPT. _1–4 RON и предварительно уравновешивают не менее 30 минут.Предварительно уравновешенные комплексы последовательно вводили в сенсорный чип для обнаружения связывания свободного MSPβ с иммобилизованным RON. Концентрацию несвязанного MSPβ рассчитывали по калибровочным кривым, где начальную скорость связывания аналита наносили на график в зависимости от концентрации аналита. Для калибровки исходные скорости связывания определяли из набора сенсограмм связывания для 1,5–12,5 нМ (дикого типа) или 4–62,5 нМ (R689C) MSPβ с иммобилизованным Sema-PSI-IPT _1–4. Каждая кривая была построена на ранней стадии ассоциации, определяя линейную корреляцию между сигналом SPR и концентрацией аналита.Эта калибровка была использована для определения концентраций свободного MSPβ в смесях RON / MSPβ, которые затем были нанесены на график в зависимости от концентраций растворимого RON и в целом адаптированы к модели сродства к раствору, давая константу равновесия сродства ( K _d) в растворе. .

Кинетические данные анализировали с использованием программного обеспечения BIAevaluation, версия 3.1 (BIAcore). Все кривые связывания были скорректированы с учетом вклада фона и объемного показателя преломления с использованием только эталонной проточной кюветы и буфера.Наборы кривых связывания в целом согласовывались с нелинейным алгоритмом наименьших квадратов с использованием одноэкспоненциальных функций (модель одновалентного связывания Ленгмюра). Кинетические параметры ( k _на и k _на) и константы равновесной диссоциации ( K _d) были определены на основании по меньшей мере двух экспериментов.

Протеолитическая активация MSP

Белки MSPβ дикого типа и R689C, использованные в этом исследовании, содержат 19 C-концевых аминокислот MSPα, слитых с N-концом β-цепи, включая Cys468 MSPα, который образует межцепочечную дисульфидную связь с Cys588 на β-цепь.Специфический протеолиз пептидной связи Arg483-Val484, которая активирует MSP, дает пептид α-цепи, который связан с β-цепью только дисульфидной связью. Расщепление белков дикого типа и R689C матриптазой-1 проводили следующим образом. Образцы, содержащие 2 мкл (500 нГ) MSPβ и 10 мкл 100 нМ матриптазы-1 (EnzoLife Sciences International, США), инкубировали в течение 4 ч при 37 ° C при молекулярном отношении субстрата к ферменту 20-1. MSPβ дикого типа и мутантный MSPβ, инкубированные в отсутствие матриптазы-1, служили контролем.Протеолитические продукты анализировали с помощью SDS-PAGE (Invitrogen) в восстановленных условиях.

Моделирование конструкций

Сравнительная модель MSPβ в комплексе с RON Sema-PSI была построена на основе доступных кристаллических структур MSPβ [22] (запись PDB 1ASU), RON Sema-PSI (Chao and Herzberg, неопубликовано) и кристаллической структуры гомологичный белковый комплекс HGFβ / MET Sema-PSI [29] (вход PDB 1SHY) (HGFβ и MSPβ имеют 43% идентичности последовательностей, а домены Sema-PSI MET и RON имеют 29% идентичность последовательностей).Модель была построена путем наложения индивидуальных белковых структур на их соответствующие гомологи в комплексе HGFβ / MET Sema-PSI с использованием программы интерактивной компьютерной графики COOT [37].

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: JM OH. Проведены эксперименты: NG KC LRP AG IT. Проанализированы данные: NG LRP IT JM OH. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: NG KC RHA. Написал статью: JM OH.

Ссылки

1.Консорциум WTCC (2007) Общегеномное ассоциативное исследование 14 000 случаев семи распространенных заболеваний и 3 000 общих контрольных заболеваний. Природа 447: 661–678.
2. Franke A, McGovern DP, Barrett JC, Wang K, Radford-Smith GL и др. (2010) Полногеномный метаанализ увеличивает до 71 числа подтвержденных локусов восприимчивости к болезни Крона. Генетика природы 42: 1118–1125.
3. Теслович Т.М., Мусунуру К., Смит А.В., Эдмондсон А.С., Стилиану И.М. и др. (2010) Биологическая, клиническая и популяционная значимость 95 локусов липидов крови.Природа 466: 707–713.
4. Yue P, Li Z, Moult J (2005) Потеря стабильности структуры белка как основной причинный фактор моногенного заболевания. Журнал молекулярной биологии 353: 459–473.
5. Юэ П., Моулт Дж. (2006) Идентификация и анализ вредоносных человеческих SNP. Журнал молекулярной биологии 356: 1263–1274.
6. Аллали-Хассани А., Васни Г.А., Чау И., Хонг Б.С., Сенистерра Г. и др. (2009) Обзор белков, кодируемых несинонимичными однонуклеотидными полиморфизмами, выявил значительную часть с измененной стабильностью и активностью.Биохимический журнал 424: 15–26.
7. Goyette P, Lefebvre C, Ng A, Brant SR, Cho JH, et al. (2008) Геноцентрическое ассоциативное картирование хромосомы 3p указывает на участие MST1 в патогенезе ВЗК. Иммунол слизистой оболочки 1: 131–138.
8. Мелум Э., Франке А., Шрамм С., Вейсмюллер Т.Дж., Готтхардт Д.Н. и др. (2011) Полногеномный анализ ассоциации при первичном склерозирующем холангите позволяет идентифицировать два локуса не-HLA-чувствительности. Нат Жене 43: 17–19.
9. Софаер Дж. (1993) Болезнь Крона: генетический вклад.Gut 34: 869–871.
10. Андерсон К.А., Бушер Дж., Лис К.В., Франке А., Д’Амато М. и др. (2011) Мета-анализ идентифицирует 29 дополнительных локусов риска язвенного колита, увеличивая количество подтвержденных ассоциаций до 47. Nature Genetics 43: 246–252.
11. Kretschmann KL, Eyob H, Buys SS, Welm AL (2010) Путь белка, стимулирующего макрофаги / Ron, как потенциальная терапевтическая мишень, препятствующая множественным механизмам, участвующим в прогрессировании рака груди.Curr Drug Targets 11: 1157–1168.
12. Wang MH, Skeel A, Leonard EJ (1996) Протеолитическое расщепление и активация протеина, стимулирующего макрофаги, резидентными протеазами мембран перитонеальных макрофагов. Дж. Клин Инвест 97: 720–727.
13. Бхатт А.С., Велм А., Фаради С.Дж., Васкес М., Уилсон К. и др. (2007) Координатная экспрессия и функциональное профилирование идентифицируют внеклеточный протеолитический сигнальный путь. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 5771–5776.
14.Бекли Дж. Б., Хэнкок Л., Геремия А., Каммингс Дж. Р., Моррис А. и др. (2008) Двухэтапное исследование гена-кандидата хромосомы 3p демонстрирует связь между несинонимичными вариантами гена MST1R и болезнью Крона. Воспаление кишечника 14: 500–507.
15. Данилкович А., Миллер М., Леонард Э. Дж. (1999) Взаимодействие белка, стимулирующего макрофаги, с его рецептором. Остатки, важные для связывания бета-цепей и свидетельства независимого связывания альфа-цепей. J Biol Chem 274: 29937–29943.
16. Waltz SE, McDowell SA, Muraoka RS, Air EL, Flick LM и др. (1997) Функциональная характеристика доменов, содержащихся в белке, подобном фактору роста гепатоцитов. J Biol Chem 272: 30526–30537.
17. Wang MH, Julian FM, Breathnach R, Godowski PJ, Takehara T. и др. (1997) Белок, стимулирующий макрофаги (MSP), связывается со своим рецептором через бета-цепь MSP. J Biol Chem 272: 16999-17004.
18. Angeloni D, Danilkovitch-Miagkova A, Miagkov A, Leonard EJ, Lerman MI (2004) Растворимый домен семы рецептора RON ингибирует активацию рецептора, индуцированную белком, стимулирующим макрофаги.J Biol Chem 279: 3726–3732.
19. Ма Кью, Чжан К., Яо Х.П., Чжоу Ю.К., Падхе С. и др. (2010) Ингибирование сигнального пути MSP-RON в раковых клетках с помощью новой растворимой формы RON, содержащей всю последовательность семы. Int J Oncol 36: 1551–1561.
20. Matsumoto K, Kataoka H, Date K, Nakamura T (1998) Совместное взаимодействие между альфа- и бета-цепями фактора роста гепатоцитов на рецепторе c-Met обеспечивает индуцированное лигандом фосфорилирование тирозина рецептора и множественные биологические ответы.J Biol Chem 273: 22913–22920.
21. Герарди Э., Сандин С., Петухов М.В., Финч Дж., Юлс М.Э. и др. (2006) Структурные основы фактора роста гепатоцитов / фактора рассеяния и передачи сигналов MET. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 4046–4051.
22. Carafoli F, Chirgadze DY, Blundell TL, Gherardi E (2005) Кристаллическая структура бета-цепи белка, стимулирующего рост гепатоцитов / макрофагов человека. Febs J 272: 5799–5807.
23. Ax DD, Foster NW, Fersht AR (1999) Неправильный бета-балдж, общий для группы бактериальных РНКаз, является важным детерминантом стабильности и функции барназы.Журнал молекулярной биологии 286: 1471–1485.
24. Пантолиано М. В., Уитлоу М., Вуд Дж. Ф., Додд С. В., Хардман К. Д. и др. (1989) Значительное повышение общей стабильности субтилизина BPN ‘за счет дополнительных изменений свободной энергии разворачивания. Биохимия 28: 7205–7213.
25. Kelley RF, Cleary S (1989) Влияние замен 65 остатка на термостабильность домена крингл-2 тканевого активатора плазминогена. Биохимия 28: 4047–4054.
26.Baase WA, Liu L, Tronrud DE, Matthews BW (2010) Уроки лизоцима фага T4. Белковая наука: публикация Protein Society 19: 631–641.
27. Холмс О., Пиллоцци С., Дикин Дж. А., Карафоли Ф., Кемп Л. и др. (2007) Понимание структуры / функции фактора роста гепатоцитов / фактора рассеяния из исследований с отдельными доменами. J Mol Biol 367: 395–408.
28. Nieba L, Krebber A, Pluckthun A (1996) Конкурс BIAcore для измерения истинного сродства: большие отличия от значений, определенных на основе кинетики связывания.Анальная биохимия 234: 155–165.
29. Stamos J, Lazarus RA, Yao X, Kirchhofer D, Wiesmann C (2004) Кристаллическая структура бета-цепи HGF в комплексе с доменом Sema рецептора Met. Embo J 23: 2325–2335.
30. Гаудино Дж., Фолленци А., Налдини Л., Коллези С., Санторо М. и др. (1994) RON представляет собой гетеродимерный рецептор тирозинкиназы, активируемый гомологом HGF MSP. Журнал EMBO 13: 3524–3532.
31. Альтшулер Д.М., Гиббс Р.А., Пелтонен Л., Дермитзакис Э., Шаффнер С.Ф. и др.(2010) Объединение общих и редких генетических вариаций в различных человеческих популяциях. Природа 467: 52–58.
32. Марчини Дж., Хауи Б., Майерс С., Маквин Дж., Доннелли П. (2007) Новый многоточечный метод для полногеномных ассоциативных исследований путем вменения генотипов. Генетика природы 39: 906–913.
33. Krawczak M, Ball EV, Fenton I., Stenson PD, Abeysinghe S, et al. (2000) База данных мутаций генов человека — биомедицинский информационный и исследовательский ресурс. Мутация человека 15: 45–51.
34. Lehr RV, Elefante LC, Kikly KK, O’Brien SP, Kirkpatrick RB (2000) Модифицированная процедура аффинной хроматографии с ионами металлов для очистки рекомбинантных белков, меченных гистидином, экспрессированных в клетках S2 Drosophila. Protein Expr Purif 19: 362–368.
35. Loo T, Patchett ML, Norris GE, Lott JS (2002) Использование секреции для решения проблемы растворимости: экспрессия с высоким выходом в Escherichia coli и очистка бактериальной гликоамидазы PNGase F.Protein Expr Purif 24: 90–98.
36. Ведади М., Низен Ф.Х., Аллали-Хассани А., Федоров О.Ю., Финерти П.Дж.-младший и др. (2006) Методы химического скрининга для выявления лигандов, которые способствуют стабильности белка, кристаллизации белка и определению структуры. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 15835–15840.
37. Эмсли П., Коутан К. (2004) Кут: инструменты построения моделей для молекулярной графики. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60: 2126–2132.

Систематическая функциональная характеристика возможных причинных генов для вариантов риска диабета 2 типа

Abstract

Большинство сигналов генетической ассоциации для риска диабета 2 типа расположены в некодирующих областях генома, препятствуя трансляции в молекулярные механизмы.Физиологические исследования показали, что большинство вариантов, связанных с заболеванием, проявляют свои эффекты через дисфункцию островков поджелудочной железы. Систематическая характеристика роли региональных транскриптов в функции β-клеток может идентифицировать лежащие в основе болезнетворные гены, но крупномасштабные исследования на человеческих клеточных моделях ранее были непрактичными. Мы разработали надежную и масштабируемую стратегию, основанную на массивном подавлении генов в линии β-клеток человека EndoC-βh2. При скрининге 300 позиционных кандидатов, выбранных из 75 регионов диабета 2 типа, каждый ген был проанализирован на предмет воздействия на несколько фенотипов, связанных с заболеванием, включая секрецию инсулина и клеточную пролиферацию.Мы идентифицировали в общей сложности 45 генов, участвующих в функции β-клеток, что указывает на возможные причинные механизмы в 37 локусах, связанных с заболеванием. Результаты показали сильное обогащение генов, участвующих в моногенном диабете. Выбранные эффекты были подтверждены в последующем исследовании, включая несколько генов ( ARL15 , ZMIZ1 и THADA ) с ранее неизвестной или плохо описанной ролью в биологии β-клеток. Мы продемонстрировали возможность систематического функционального скрининга на модели человеческих β-клеток и успешно установили приоритетность вероятных болезнетворных генов в более чем половине исследованных регионов.

Введение

Риск диабета 2 типа определяется сложным взаимодействием между экологическими и генетическими факторами, с оценками наследственности от 20% до 80% (1). За последнее десятилетие все возрастающие масштабы полногеномных ассоциативных исследований (GWAS) выявили более 100 участков генома (локусов), связанных с риском диабета 2 типа (2). Исследования на людях с диабетом показали, что большое количество этих ассоциативных сигналов оказывает влияние на восприимчивость к заболеванию через дисфункцию островков поджелудочной железы (3).

Несмотря на эти достижения, преобразование генетических данных в биологию болезней было относительно медленным. Большинство вариантов риска локализованы в некодирующих областях генома, и точное определение лежащих в основе причинных генов или «эффекторных транскриптов» оказалось сложной задачей (4). Недавние усилия были сосредоточены на идентификации структурных или функциональных связей между ассоциативными сигналами и региональными генами (5,6). Дополнительная стратегия использует биологию генов-кандидатов для определения приоритета генов, расположенных рядом с сигналами ассоциации.Высокопроизводительный скрининг может облегчить идентификацию генов, участвующих в функции β-клеток, и тем самым выявить потенциальные эффекторные транскрипты в локусах GWAS диабета 2 типа. На сегодняшний день такие подходы ограничены неадекватностью доступных человеческих клеточных моделей и высокой стоимостью иммуноанализа на инсулин (~ 2 доллара за точку данных), золотого стандарта измерения инсулина. Чтобы обойти эти проблемы, предыдущие исследования опирались на модели β-клеток грызунов и либо использовали репортерные анализы в качестве прокси для измерения инсулина, либо были сосредоточены на клеточной пролиферации (7–11).

Недавно была создана первая линия человеческих β-клеток, чувствительных к глюкозе, EndoC-βh2 (12,13). Эта линия происходит из зачатков поджелудочной железы плода, созревших in vivo, и демонстрирует умеренную, но надежную индукцию секреции инсулина в ответ на глюкозу и стимуляторы секреции. Подробные характеристики показали, что клеточная линия является аутентичной модельной системой для изучения секреции, связанной со стимулами (14–16).

Чтобы ускорить открытие причинных генов диабета 2 типа, в текущем исследовании был проведен и подтвержден генетический скрининг линии клеток EndoC-βh2.Мы идентифицировали гены в половине изученных локусов, связанных с диабетом 2 типа (37/75), где опосредованное малыми интерферирующими РНК (siRNA) сайленсинг приводил к дисфункции β-клеток. Это демонстрирует возможность проведения систематического скрининга секреции инсулина на модели человеческих β-клеток, что имеет значение как для высокопроизводительного генетического скрининга, так и для скрининга химических соединений. Наши результаты могут быть объединены с существующими линиями доказательств для определения приоритета эффекторных транскриптов в локусах GWAS и выделения потенциальной роли ARL15 , ZMIZ1 и THADA в регуляции секреции инсулина.

Дизайн и методы исследования

RNA-seq

Клеточную линию EndoC-βh2 культивировали, как описано ранее, и выращивали почти до слияния (12). Затем РНК была экстрагирована TRIzol и секвенирована в Оксфордском центре геномики (Wellcome Trust Centre for Human Genetics, Оксфордский университет) (подробности см. На дополнительном рисунке 4). Необработанные данные секвенирования были депонированы в Европейском архиве нуклеотидов (http://www.ebi.ac.uk/ena) под номером доступа PRJEB15283.

Клеточные анализы

Клеточные фенотипы были адаптированы для автоматического скрининга на рабочей станции для работы с жидкостями PerkinElmer Janus на основе ранее описанных анализов (дополнительный рис.1 А ) (17). Вкратце, 20000 клеток / лунку подвергали обратной трансфекции в 96-луночном формате при конечных концентрациях миРНК 25 нмоль / л, предварительно инкубируя с 0,2 мкл RNAiMAX в Opti-MEM. Пользовательские библиотеки миРНК (ON-TARGETplus SMARTpools [Dharmacon] для первичного скрининга и Silencer Select [Thermo Fisher Scientific] для последующей проверки) были разработаны на основе критериев, описанных в дополнительной таблице 2. В каждом случае нецелевые (NT) последовательности на основе того же химического состава, были использованы в качестве отрицательного контроля.Через три дня после трансфекции клетки голодали в течение ночи в полной среде, содержащей 2,8 ммоль / л глюкозы, с последующим 1-часовым голоданием в среде 0 ммоль / л. Затем проводили статические анализы секреции инсулина в течение 1 ч в полной среде при указанных условиях, после чего клетки подсчитывали, как описано ниже.

Анализ образца

После анализов секреции супернатанты анализировали на содержание инсулина с использованием иммуноанализа человеческого инсулина AlphaLISA (PerkinElmer) на планшет-ридере PHERAstar FS (BMG Labtech).Супернатанты (50–250 нл) и гранулы, предварительно разведенные в воде (500 нл), разливали в 384-луночные микропланшеты с акустическим жидкостным манипулятором Echo 550 (Labcyte) перед добавлением вручную буфера для иммуноанализа до конечного объема 5 мкл. Подсчет клеток измеряли с использованием набора CyQUANT Direct Cell Proliferation (Thermo Fisher Scientific) на планшет-ридере EnVision (PerkinElmer). Все ответы были нормализованы, как указано (см. Соответствующие подписи к рисункам), и выражены как процент от NT контроля для каждого фенотипа.Величина эффекта представлена в виде процентного отличия от NT ( Response _Gene — Response _NT) и их абсолютных значений (| Response _Gene — Response _NT |).

Статистический анализ

Анализ данных выполнялся с использованием R 3.0.2. Для выявления значимых ответов подсчет клеток и нормализованные измерения секреции инсулина для каждого гена сравнивали с контролем NT с использованием теста Стьюдента с двумя выборками t .Уровень ложного обнаружения (FDR) контролировался на уровне 5% с помощью процедуры Бенджамини-Хохберга для получения скорректированных значений P (значения q) для каждого фенотипа. Z-фактор, измеряющий контрольную реакцию для каждого фенотипа, был рассчитан как

Результаты

Сначала мы разработали автоматизированный анализ фенотипов, связанных с заболеванием, в линии β-клеток человека EndoC-βh2 (дополнительный рисунок 1 A ). Выбранные мишени замолчали в параллельном формате с использованием РНК-интерференции.Затем клетки оценивали на предмет влияния на количество клеток и секрецию инсулина в четырех различных условиях: низкий уровень глюкозы (1 ммоль / л), высокий уровень глюкозы (20 ммоль / л) и высокий уровень глюкозы с толбутамидом сульфонилмочевины (100 мкмоль / л) или с ингибитор фосфодиэстеразы IBMX (100 мкмоль / л). Условия с низким и высоким содержанием глюкозы были включены, чтобы предоставить информацию о влиянии сайленсинга генов в условиях, представляющих состояния голодания и приема пищи in vivo. Толбутамид и IBMX действуют на деполяризующие и потенцирующие пути секреции инсулина, соответственно, и были включены для получения дополнительных сведений о механизмах посредством модуляции (например,g., синергизм или фармакологическое спасение) любых первичных дефектов, наблюдаемых при низком или высоком уровне глюкозы.

Чтобы снизить стоимость анализа образцов, мы использовали акустическую обработку жидкости для миниатюризации иммуноанализа инсулина. Этот обобщаемый метод позволил нам сохранить высокую чувствительность при измерениях инсулина (коэффициент вариации <3%) (дополнительный рисунок 2 A и B ), в то же время получив 10-кратное снижение стоимости анализа образцов (0,20 доллара США за точка данных). Используя ген инсулина ( INS ) в качестве положительного контроля, мы подтвердили, что мы смогли надежно обнаружить эффекты сайленсинга генов на фенотипы нашего анализа (среднее значение Z ‘= 0.6 в разных условиях) (дополнительный рис. 3).

На основе этого комбинированного анализа и анализа мы разработали первичный скрининг для оценки роли позиционных генов-кандидатов для локусов GWAS диабета 2 типа в функции β-клеток (дополнительный рис. 1 B ). Для отбора мишеней мы рассмотрели все гены, кодирующие белок, расположенные в пределах 1 Мб от сигнала ассоциации диабета 2 типа. Чтобы исключить гены, не экспрессируемые в нашей клеточной модели, мы выполнили полногеномное секвенирование РНК EndoC-βh2.Наши данные по экспрессии сильно коррелировали с опубликованными данными секвенирования для обогащенных первичных β-клеток (ρ = 0,78) (дополнительный рис. 4) и показали устойчивую экспрессию ключевых генов β-клеток (12,18) (дополнительная таблица 1). Мы включили только гены, экспрессируемые как в EndoC-βh2, так и в первичных β-клетках (дополнительная таблица 2), что привело к включению 300 позиционных кандидатов из 75 локусов GWAS диабета 2 типа.

Затем мы провели наш первичный скрининг в трех повторностях и получили стандартизированные баллы для каждого фенотипа.Нокдаун был явно подтвержден с использованием PLK1 , важного гена, который вызвал обширную гибель клеток во всех условиях. В репрезентативной подгруппе из 16 генов мы оценили эффективность нокдауна на уровне транскрипта и обнаружили, что медиана остаточной экспрессии составляет 43% (дополнительный рис. 5), что примерно эквивалентно моноаллельной потере функции. Чтобы учесть различия в эффективности посева и пролиферации, подсчет клеток использовался для нормализации данных секреции инсулина для каждой лунки.Затем были применены два критерия для выявления устойчивых эффектов («совпадений»): 1 ) значение q с поправкой на FDR <0,05 и 2 ) абсолютный размер эффекта среди верхних 5% (дополнительный рисунок 6). Это выявило в общей сложности 67 совпадений (15 для подсчета клеток и 52 для фенотипов секреции инсулина) между 45 генами в 37 локусах (Таблица 1).

Таблица 1
Эффекты значимых совпадений, выявленные при первичном скрининге на дисфункцию β-клеток
Для количества клеток, величина эффекта для каждого гена была оценена на основе 12 независимых повторностей в чашках (четыре условия в трех повторностях) и, следовательно, вероятно, представляют истинные различия в клеточная пролиферация и / или жизнеспособность, а не эффекты случайного посева.Помимо KIF11 , гена с известной ролью в делении клеток, наибольшие размеры эффекта по сравнению с контролем NT (коэффициент вариации = 4% для количества клеток) наблюдались для ZMIZ1 (-15,2%; значение q = 6,5). × 10 ⁻⁵) и PRDX3 (+ 16,6%; значение q = 9,2 × 10 ⁻⁵).
Для данных о секреции инсулина мы сначала выполнили анализ обогащения для генов, участвующих в развитии диабета у молодых людей в зрелом возрасте (MODY). MODY описывает набор моногенных подтипов диабета, характеризующихся недостаточным высвобождением или производством инсулина.Как и следовало ожидать от набора настоящих регуляторов функции β-клеток, мы наблюдали сильное обогащение генов MODY среди значимых совпадений (точный критерий Фишера, P = 5,5 × 10 ⁻⁹). Агрегирование абсолютных величин эффекта для генов MODY и не-MODY показало, что это обогащение вызвано измененной секрецией инсулина, а не влиянием на количество клеток (рис. 1).
Рисунок 1
Сравнение средней абсолютной величины эффекта для генов MODY и не-MODY. Коробчатые диаграммы средних абсолютных величин эффекта для генов MODY и генов, не являющихся MODY (за исключением контроля), по пяти измеренным фенотипам.Величину эффекта рассчитывали, как описано в таблице 1, а затем усредняли абсолютные значения для двух категорий генов. Среди 14 идентифицированных генов MODY 8 соответствовали критериям для включения в экран: HNF4A , GCK , HNF1A , HNF1B , PAX4 , INS , ABCC8 CN и

95. Тол, толбутамид. Коробчатые диаграммы показывают медианные и межквартильные диапазоны для групп из n = 8 и 292 точек данных.*** Значение q <0,001 по тесту Student t (с поправкой на FDR).

Далее подтверждая наши данные о секреции, мы наблюдали сильную положительную корреляцию между нормализованными ответами в разных условиях ( P <2,2 × 10 ⁻¹⁶) (рис. 2) и обнаружили, что 10 из 35 генов вызывают значительные эффекты при двух или больше условий. Это включало четыре известных гена MODY и ZMIZ1 , который, независимо от влияния на количество клеток, был одним из самых сильных факторов снижения секреции инсулина (значение q <0.01 для низкого и высокого уровня глюкозы). Обнаружено, что нокдаун гена ABCC8 , который кодирует субъединицу АТФ-чувствительного калиевого канала, значительно увеличивает секрецию инсулина при низком уровне глюкозы и стимуляции IBMX. Как и ожидалось, вызванная этим деполяризация была замаскирована высоким уровнем глюкозы (поскольку клетки уже частично деполяризованы) и полностью устранена толбутамидом (из-за фармакологической деполяризации клеток). Таким образом, паттерн модуляции условиями секреции можно использовать для точного определения конкретных биологических путей, на которые влияет молчание генов.Чтобы изучить взаимосвязь между условиями более подробно, мы выполнили кластерный анализ по Z-баллам, полученным из нормализованных значений секреции. Это показало, что высокий уровень глюкозы и толбутамида наиболее схожи с точки зрения модулирующих эффектов нокдауна, а низкий уровень глюкозы и толбутамид наиболее различаются (дополнительный рисунок 7).

Рисунок 2

Сравнение данных секреции инсулина для высокого и низкого уровня глюкозы. Нормализованные ответы секреции инсулина при высоком уровне глюкозы по сравнению с низким уровнем глюкозы с аннотированием выбранных результатов.Синий кружок указывает на 95% -ный контур достоверности для контроля NT, а оранжевый кружок указывает на 95% -ный доверительный контур для INS -положительных контролей. Все измерения были нормализованы для каждой лунки по количеству клеток, а затем средние значения для каждого условия были затем нормализованы до среднего значения NT контроля. Точки данных представляют собой среднее значение n = 3 и показаны как процент от контроля NT.

Наконец, мы оценили вклад нецелевых эффектов, выполнив небольшой эксперимент по валидации с использованием миРНК, разработанных с использованием альтернативного алгоритма.Было подтверждено, что последовательности отличаются от последовательностей первичного скрининга и, таким образом, могут быть использованы для установления биологической значимости положительных совпадений. Мы выбрали восемь генов-мишеней, представляющих совпадения как для положительных, так и для отрицательных дефектов в четырех условиях, и подтвердили, что эффективность нокдауна была удовлетворительной (медиана остаточной экспрессии = 19,3%) (дополнительный рис. 8). По сравнению с результатами секреции инсулина при первичном скрининге мы наблюдали отличную линейную корреляцию (ρ = 0.85, P = 6,7 × 10 ⁻¹⁰) (дополнительный рисунок 9) и 88% согласованности по направлению в нормализованных ответах. Проверенные совпадения включали несколько генов с ограниченными предварительными доказательствами роли в регуляции функции β-клеток, в том числе ARL15 и ZMIZ1 , которые, как было обнаружено, значительно снижают секрецию инсулина в разных условиях (значения q <0,05) (рис. 3 A и B ) и THADA, , которые незначительно повышали секрецию инсулина в трех условиях, хотя эффект при низком уровне глюкозы не наблюдался при первичном скрининге (значение q = 5.6 × 10 ⁻³) (рис.3 C ). Интересно, что подавление гена известного гена MODY HNF4A было подтверждено как вызывающее парадоксальное увеличение секреции инсулина во всех четырех испытанных условиях (значения q <0,001) (фиг. 3 D ).

Рисунок 3

Данные секреции инсулина для выбранных генов в ходе последующего проверочного эксперимента. Секреция инсулина для ARL15 ( A ), ZMIZ1 (B ), THADA ( C ) и HNF4A ( D ) (белые столбцы) по сравнению сNT (черные полосы) отрицательный контроль при указанных условиях. Измерения обрабатывали, как описано для фиг. 2, и отображали в процентах от контроля NT. Тол, толбутамид. Точки данных представляют собой среднее значение n = 6 для NT и n = 3 для других генов, а планки ошибок — SEM. + значение q <0,1, * значение q <0,05, ** значение q <0,01, *** значение q <0,001 по тесту Student t (с поправкой на FDR).

Обсуждение

Высокопроизводительный скрининг на дисфункцию β-клеток дает возможность систематически охарактеризовать роль генов в ткани, связанной с заболеванием, при диабете 2 типа.Предыдущие усилия были сосредоточены на нечеловеческих модельных системах (7-10), репортерных прокси-измерениях для инсулина (7,8) и / или фенотипах, не связанных напрямую с производством и секрецией инсулина (10,11). Здесь мы сообщаем о стратегии генетического скрининга для исследования нескольких фенотипов, связанных с заболеванием, в линии β-клеток человека EndoC-βh2. При первичном скрининге 300 позиционных кандидатов мы успешно идентифицировали 15 генов, регулирующих количество клеток (пролиферацию и / или жизнеспособность), и 35 генов, регулирующих секрецию инсулина.Насколько нам известно, это первая систематическая крупномасштабная попытка идентифицировать гены, участвующие в секреции инсулина. Важно отметить, что идентифицированные совпадения могут быть использованы для определения приоритета новых эффекторных транскриптов для локусов GWAS диабета 2 типа и могут пролить дополнительный свет на механизмы, лежащие в основе генов, ранее участвовавших в дисфункции β-клеток.

Неожиданно было обнаружено, что известный ген MODY HNF4A вызывает последовательное увеличение (> 40%) секреции инсулина во всех условиях. HNF4A кодирует фактор транскрипции HNF4α и мутирует примерно в 10% всех случаев MODY (19). HNF4A Мутации с потерей функции , которые вызывают моногенный диабет в более позднем возрасте, также были связаны с увеличением массы тела при рождении (что указывает на повышенную секрецию инсулина плода) и врожденным гиперинсулинизмом в раннем младенчестве (20). Основная причина этого перехода от повышенной к пониженной секреции инсулина неизвестна, но предполагалось, что в основе этого явления может лежать постепенное истощение β-клеток или, альтернативно, сдвиг в модулирующих кофакторах HNF4α (21,22).

Среди совпадений с ограниченными предварительными доказательствами роли в функции β-клеток мы независимо проверили ZMIZ1 , ARL15 и THADA . Недавно было показано, что сверхэкспрессия и нокдаун ZMIZ1 , кодирующего ZMIZ1, отрицательно влияет на секрецию инсулина в первичных островках человека (6). Более того, близлежащий сигнал ассоциации диабета 2 типа перекрывает цис- — локусы количественных признаков для гена, подтверждая его кандидатуру в качестве регионального эффекторного транскрипта (6). ARL15 кодирует ARL15, относительно не охарактеризованный член семейства белков ARF, участвующих в регуляции переноса везикул и биогенеза. Ген в высокой степени экспрессируется в β-клетках и расположен ниже энхансера, активного в отношении островков, связанного с ключевыми факторами транскрипции β-клеток (18,23) (дополнительный рисунок 10 A ). THADA кодирует белок THADA и содержит кодирующий сигнал ассоциации с заболеванием, который также был связан со сниженной функцией β-клеток (24) (дополнительный рис.10 С ). В соответствии с направленностью наших результатов, профили экспрессии показали, что ген более высоко экспрессируется у пациентов с диабетом 2 типа по сравнению с контрольными субъектами (25). Таким образом, все три гена становятся сильными кандидатами для будущих исследований.

Несмотря на то, что наша текущая стратегия скрининга успешно обеспечивает объективную функциональную характеристику, она имеет ряд ограничений. Ложноотрицательные результаты (т.е. истинные причинные гены, не идентифицированные как совпадения) могут возникать в результате первичного воздействия причинного гена на ткани, не являющиеся β-клетками, или посредством воздействия на гены, экспрессируемые на разных стадиях развития.Аналогично, в некоторых случаях может потребоваться сверхэкспрессия или более высокая эффективность нокдауна, чтобы выявить относящийся к заболеванию фенотип. Среди мишеней, проанализированных на эффективность сайленсинга, наблюдался переменный диапазон нокдауна (34% -88%), и некоторые гены могли оставаться необнаруженными из-за недостаточного сайленсинга. И наоборот, ложноположительные эффекты (т.е. регуляторы, не относящиеся к β-клеткам, идентифицированные как попадания) также не могут быть исключены, и неожиданные результаты должны быть дополнительно функционально подтверждены (например, эффект SLC2A4 на секрецию инсулина, стимулированную IBMX).Хотя было обнаружено, что линия клеток EndoC-βh2 воспроизводит многие аспекты функции β-клеток, остается вероятность того, что некоторые результаты не будут переведены непосредственно в физиологию человека. Наконец, подмножество идентифицированных совпадений может представлять истинные регуляторы β-клеток, которые не зависят от каких-либо вариантов риска заболевания и, хотя все еще имеют биологическое значение, не подлинные эффекторные транскрипты для диабета 2 типа. В дополнение к возможности наличия более одного эффекторного транскрипта на локус, это явление, вероятно, также способствует относительно высокой доле мультихит-локусов, наблюдаемых при первичном скрининге (8/37).

Несмотря на эти ограничения, наша стратегия скрининга успешно воспроизвела хорошо известные биологические механизмы и идентифицировала гены, участвующие в функции β-клеток в половине исследованных локусов. Это впервые демонстрирует возможность проведения масштабируемого скрининга на секреторные дефекты инсулина в β-клетках поджелудочной железы человека и открывает возможность не только крупномасштабных генетических манипуляций, но и комплексного высокопроизводительного скрининга для терапевтического воздействия на β-клетки человека. клетки.Понимание этого и последующих функциональных скринингов может быть объединено с дополнительными линиями доказательств из исследований ассоциаций на уровне экзома, захвата конформации хроматина и исследований локусов количественных признаков цис -экспрессии для определения приоритетности генов для последующих исследований. В конечном итоге это может ускорить трансляцию сигналов генетической ассоциации в молекулярные механизмы дисфункции β-клеток, инсулиновой недостаточности и диабета 2 типа.

Информация о статье

Финансирование. Это исследование финансировалось в Оксфорде фондом Wellcome Trust (095101 / Z / 10 / Z и 098381). S.K.T. является стипендиатом медицинского факультета Рэдклиффа. М.И.М. является старшим исследователем Wellcome Trust. A.L.G. является старшим научным сотрудником Wellcome Trust в области фундаментальных биомедицинских наук.

Двойственность интересов. M.v.d.B. поддерживается постдокторской стипендией Ново Нордиск, проводимой в партнерстве с Оксфордским университетом. О других потенциальных конфликтах интересов, относящихся к этой статье, не сообщалось.

Вклад авторов. S.K.T., A.C., D.E., M.I.M. и A.L.G. задумал и разработал исследование. S.K.T., M.v.d.B., M.I.M. и A.L.G. проанализировали и интерпретировали данные. S.K.T., A.C., C.B. и A.B. проводил эксперименты. Р.С. предоставлены протоколы. S.K.T., M.I.M. и A.L.G. написал рукопись. S.K.T., A.C., M.v.d.B., C.B., A.B., R.S., D.E., M.I.M. и A.L.G. отредактировал и утвердил рукопись. A.L.G. является гарантом этой работы и, как таковой, имеет полный доступ ко всем данным в исследовании и берет на себя ответственность за целостность данных и точность анализа данных.

Предварительная презентация. Части этого исследования были представлены на 52-м ежегодном собрании Европейской ассоциации по изучению диабета, Мюнхен, Германия, 12–16 сентября 2016 г.

Получено 17 марта 2016 г.
Принято 18 августа 2016 г.

Геномная характеристика предполагаемого деления LCP-89 выявляет атипичную структуру клеточной стенки, образование микрокомпартментов и двойную респираторную и ферментативную способности

914 914 914 Geptiram 9146 914 914 914 Peptiram 914 914 914 Pepti ✓14 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 ✓ 914 914 914 914 4 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 91444 914 965 914 914 914 914 914 914 914 64 Хемотаксис 9146 914 Стержень, определяющий форму стержня4 9146 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 9141476 914 914 914 914 914 914 914 Окислительный стресс 914 914 964 914 964 914 964 Семейство 914 964 Fe / ✓ 14 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 64 ✓ 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 ✓ 9146 4 914 914146 914 914 ✓ ✓ 914 914 965 914 914 964 ✗ 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 Неокислительная ветвь 9146 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 Gln Ser от Gly4 ✓144 ✓144 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 9 1464 ✓ ✓ 9146 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 Биосинтез кофакторов 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 ✓4444 НАД / НАДП 91 464 ✓ ✓14914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 Ацильный белок-носитель14 964 9 1464 ✓1464 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 Doud14914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 964 914 914 914 914 914 Фукоза 14 914 914 914 914 Фукоза 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 ✓ 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 Арабин4 914 914 914 964 914 914 914 964 964 914 914 964 914 ✓ Glu 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 ✓ 9146 4 ✗ 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 ✓ 64 Частично 914 914 914 964 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 ✗ 9146 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 -CoA ✓ 914 914 ✓ 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 64 914 914 914 914 914 914 964 9144 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 комплекс II)5 btoch 2 редуктаза (высокое сродство к O ₂, комплекс IV)1465 9146 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 9146 9146 9146 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 9146 914 914 964 914 914 914 914 964 914 914 914 914 964 914 914 914 914 964 914 914 914 914 964 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 6 914 914 914 914 914 6 914 ✗ 914 914 914 914 914 914 914

Структурные особенности

Биосинтез ЛПС

✓

Доменный белок гомологии S-слоя

✓

✗

✓

Биосинтез CMP-легионамината из UDP- 000 N- Ndia

✓

✗

Частичное (1 геном)

Глицерофосфолипид клеточной мембраны

Кардиолипин

✗

✓

Фосфатидилсерин

✓

Подвижность жгутиков

✗

✓

Форма ячейки

✓

Бактериальные микрокомпартменты (BMC)

✓

Система CRISPR-Cas

✓

Эндонуклеазы рестрикции

6 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 ✓

✓

Тип II

✓

Тип III

✓

Супероксиддисмутаза

Семейство Ni

✓

✗

✓

✗

✓

Семейство Cu / Zn

✓

✗

✓

Пероксидаза

✗

✓

✗

Рубреритрин

✓

✗

✓

Алкилгидропероксидредуктаза

✓

✗

✓

Биосинтез

Глюконеогенез 6565

914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914

NAD-зависимый (EC 1.2.1.12)

✓

НАДФ-зависимая (EC 1.2.1.9)

✓

✗

✓

NAD (P) -зависимый (EC 1.2.1.59)

✗

✓

✗

Фосфоглицерат мутаза

9146 914 914

3-дифосфоглицерат-зависимый (EC 5.4.2.11)

✗

✓

✗

✓

✗

2,3-дифосфоглицератнезависимый (EC 5.4.2.12)

✓

Обращение пируваткиназы через:

Пируватфосфат дикиназа (EC 2.7.9.1)

Пируват-водная дикиназа (EC 2.7.9.2)

✓

✗

✓

✗

Пируваткарбоксилаза (EC 6.4.1.1) и PEP карбоксиказа (ATP) (EC 4.1.1.49)

✓

✗

Пентозофосфатный путь

Окислительная ветвь

✓

Аминокислоты

✓

Asn от Asp

✓

✗

✓

Glu из альфа-кетоглутарата

✓

Cys от Ser

✓

✗

✓

Thr от Gly

✓

Gly от Ser

✓

✓ 63 914 ✓

Met из Cys

✓

✗

✓

Lys (диаминопимелат инте промежуточные звенья)

✓

Arg из Glu

✗

✓

✗

✓

Leu

✓

964 964 14 ✓ 914 914 964 914 964 914 914 914 914 914

Tyr

✓

Phe

✓

✗

✓

Ala

✓

✗

✓

His

✓

✗

✓

Pro

✓

Биосинтез тиамина

✗

✓

✗

✓

Рибофлавин

✓

Пиридоксальфосфат

✓

Пантотенат

✓

Коэнзим A

✓

Биосинтез биотина из пимелата

✗

✗14 14 914 914 914 914 914 914 914

914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 система транспорта фактора взаимодействия энергии), а затем лигирование с ферментами

✓

Биосинтез липоевой кислоты из октаноил-ACP

✓

✗

Утилизация липоевой кислоты

✗

✓

Биосинтез фолиевой кислоты из GTP

✓

Частично

✓

Кофактор молибдена 6514 914 914 914 964 914 914 914 964 914 914 964 914 914 914 914 964 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 ✗

Биосинтез гема из Glu

✗

✓

✗

Частичный

✓

Путь MEP / DOXP для биосинтеза терпеноидного остова ✓6565656414 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 914 ✓

Мевалонатный путь для биосинтеза терпеноидного остова

✗

✓

✗

✓

Менахинонный путь биосинтеза 14 914 914 6564 914 914 914 914 914 6564 914 914 914 914 914 6564 914 14 914 914 14 914 14 914 6564 ✓

Менахинон биос синтез из терпеноидов и изохоризмата

✗

✓

✗

Катаболизм

Глюкоза (ЭМП)

✓

Глюкоза 9off ✗

✗

Частично

Манноза ✓

✓

Галактоза

Фруктоза

✓

✓ 9 1465

✓

✗

✓

Маннитол-1-П

✗

✓

✗

✓

Сорбитол

✓

✗

✓

✗

✓

Рамноза

✓

✗14

✓

✗

✓

Ксилитол

✓

✗

✓

✗

Лактоза

✓

Катаболизм аминокислот

Ala

✓

Asn

✗

✓

✗

✓

Gln

✗

✓

✗

His

✗

✓

Cys

✓

Ser

✗

✓

Gly

✓

✗

Val

✗

Частично

✓

Ile

✗

Частично

✓14

✓

Pro

✓

Продукты метаболизма

Судьба пирувата

Пируват: ферредоксин оксидоредуктаза

✓

✓ 914 914 9146

✓

Ацетил-КоА в ацетат

Ацетил-КоА-синтетаза (EC 6.2.1.1)

✗

✓

Фосфат ацетилтрансфераза и ацетаткиназа (EC 2.3.1.8 и EC 2.7.2.1)

✓

Производство этанола из ацетил-КоА

✓

✗

✓

Производство формата из пирувата

✓

Производство л-лактата из пирувата

✗

✓

✗

Производство d-лактата из пирувата

✓

Производство ацетоина из пирувата (через ацетолактат)

✓

✗ 9146 5

✗

Производство бутандиола из ацетоина

✓

✗

Производство пропанола из разложения фукозы / рамнозы 914 914 964 914 964 914 964 914 964 914 964 914 914 964

✓

Производство пропионата из разложения фукозы / рамнозы

✓

✗

✓

Цикл TCA

✓

Дыхание

НАДН дегидрогеназа (комплекс I)

Частичное

Частично

✓

Цитохром c редуктаза (комплекс III)

✗

✓

✗

✓

✗

✓

Цитохром c оксидаза (комплекс IV)

а. )

✗

✓

✗

АТФ-синтаза (сложная V)

Оба типа F и V

Тип F

Тип F и V

Тип F

Диссимиляционное восстановление нитритов до аммиака

9146

Периплазматическая нитратредуктаза NapAB (EC 1.7.99.4)

✗

✓

Нитритредуктаза NADH (EC 1.7.1.15)

✗

Нитритредуктаза (цитохром; образование аммиака) (EC 1.7.2.2)

✓

✗

✓

✗

Восстановление серы с помощью полисульфида (EC 1.12..4)

✗

✓

Тиосульфатредуктаза / полисульфидредуктаза

✗

✓

✗

Тиосульфатдегидрогеназа

✗

✓

✗ 91 465

✓

Тетратионатредуктаза

✗

✓

Диссимиляционная сульфатредуктаза

✗

✓

✗

Сульфат-аденилилтрансфераза

✗

914 914 914

✓

✗

Хинон-взаимодействующий мембраносвязанный оксидоредуктазный комплекс (QmoABC)

✗

✓

✗

.
No related posts.