Содержащиеся в ЕГРЮЛ/ЕГРИП сведения можно получить бесплатно

Содержащиеся в ЕГРЮЛ/ЕГРИП сведения  можно получить бесплатно

Межрайонная ИФНС России № 3 по Забайкальскому краю  сообщает, что в соответствии с пунктом 1 статьи 7 Федерального закона от 8 августа 2001 года № 129-ФЗ «О государственной регистрации юридических лиц и индивидуальных предпринимателей» предусмотрено бесплатное предоставление содержащихся в ЕГРЮЛ/ЕГРИП сведений о конкретном юридическом лице/индивидуальном предпринимателе в форме электронного документа.

Получить сведения можно с помощью сервиса сайта ФНС России www.nalog.ru  «Риски бизнеса: Проверь себя и контрагента». Данный сервис предоставляет возможность заинтересованным лицам бесплатно получить сведения из ЕГРЮЛ/ЕГРИП о конкретном юридическом лице/индивидуальном предпринимателе в виде выписки из соответствующего реестра/справки об отсутствии запрашиваемой информации в форме электронного документа, подписанного усиленной квалифицированной электронной подписью. Сведения в сервисе актуализируются ежедневно.

Для получения выписки/справки сертификат ключа электронной подписи заявителя не требуется.

Государственная пошлина не взимается при направлении документов о госрегистрации в электронной форме

Межрайонная ИФНС России № 3 по Забайкальскому краю сообщает, что с  1 января 2019 года при направлении в электронной форме в регистрирующий орган документов, необходимых для совершения юридически значимых действий, связанных с государственной регистрацией юридических лиц и индивидуальных  предпринимателей, государственная пошлина не взимается.         

Указанные изменения в ст. 333.35 Налогового кодекса Российской Федерации внесены Федеральным законом № 234-ФЗ от 29.07.2018  «О внесении изменения в статью 333.35 части второй Налогового кодекса Российской Федерации».

Документы для государственной регистрации в электронном виде можно представить с помощью Интернет-сервиса «Государственная регистрация юридических лиц и индивидуальных предпринимателей» на сайте ФНС России www.nalog.ru, через нотариусов,  а также,  воспользовавшись услугами МФЦ Забайкальского края.

проверка контрагентов. Проверка контрагентов по методике ФНС

Тариф на год	0 ₽ Бесплатно 24 часа	23 900 ₽ 12 месяцев	31 900 ₽ 12 месяцев
Основные сведения по контрагенту В разделе «Основное» представлена основная информация о контрагенте. Она удобно сгруппирована по разделам: реквизиты, контакты, основной вид деятельности, управление, учредители, сведения о регистрации в фондах.
Запрос документов На основании анализа данных по контрагенту сервис сам сформирует список необходимых документов и предложит готовый текст запроса, который можно скопировать и отправить по электронной почте.
Отчеты для налоговой Сервис проверяет наличие признаков однодневки, платежеспособность, ресурсы, риск неисполнения сделки, деловую репутацию и активность за последний год. Именно эти признаки налоговики и суды признают значимыми доказательствами. Все отчеты в сервисе «Главбуха» подписаны ЭЦП и одобрены инспекторами.
Рекомендации эксперта журнала «Главбух» Эксперты журнала «Главбух» анализируют информацию по контрагенту и предлагают уже готовые выводы с правовым обоснованием. Советы экспертов помогают решить, работать ли с контрагентом, какие риски нужно предусмотреть и как их снизить, если у компании имеются негативные факторы.
Мониторинг изменений Автоматическое отслеживание изменений в ЕГРЮЛ у контрагента помогает не пропустить ликвидацию, банкротство или смену статуса из-за присоединения к однодневке. На отслеживание можно поставить неограниченное количество компаний. Уведомления об изменениях приходят на электронную почту.
Связанные компании Комплексное досье на ближайшее окружение контрагента. Наглядные схемы связей по руководителям, директорам и дочерним компаниям помогают быстро отследить связи с однодневкой.
Проверки генпрокуратуры Сводные данные о прошедших и предстоящих плановых и внеплановых проверках: дата и время проведения проверки, место нахождение проверяемого объекта и ведомства, которое проводит проверку, отчет о нарушениях по прошедшим плановым и внеплановым проверкам.
Финансы Развернутый финансовый анализ компании. Показатели ликвидности компании, её финансовой устойчивости и платёжеспособности. Можно отследить денежные потоки, налоговую нагрузку, соотношение собственных и заемных средств.
Арбитраж Сводка по инстанциям и типам дел, в которых участвует контрагент как истец, ответчик или третья сторона, с указанием суммы спора и решением, которое вынес суд по спору.
Исполнительные производства Сведения о том, какие взыскания наложили на контрагента. По каждому производству можно посмотреть: его номер и дату возбуждения, сумму, предмет, исполнительный документ и отдел судебных приставов.
Лицензии В разделе представлены действующие лицензии, закончившиеся и просроченные. По каждой лицензии можно посмотреть ее наименование, номер, место и дату начала действия.
Оценка рисков выездной налоговой проверки Калькулятор вероятности налоговой проверки в разрезе конкретной сделки по типу договора и сумме.
Массовая проверка Экспресс-проверка с выводами по каждому контрагенту из приложений 8 и 9 к декларации по НДС или книг продаж и покупок, выгруженных из любой учетной программы.
Проверка договоров Экспрессанализ договора на предмет договорных рисков и сверяет реквизиты с данными в ЕГРЮЛ.
Банковские блокировки «Главбух Контрагенты» показывает блокировки счетов от ФНС с детализацией
Выписка из ЕГРЮЛ Неограниченное количество скачиваний выписок по контрагентам с подписью ФНС
Выписка из ЕГРН Неограниченное количество выписок из ЕГРН о праве собственности и о переходе прав собственности по кадастровому номеру.
Бухотчетность Неограниченное количество скачиваний годовой бухгалтерской отчетности за предыдущий отчетный период с подписью налоговой.
Проверка паспорта Неограниченное количество проверок действительности паспортов по серии и номеру документа.
Личный помощник главбуха Весь рабочий день с вами на связи живой человек — эксперт Электронной системы Главбух. Помогает вам с решением коротких бухгалтерских или налоговых вопросов, не требующих углубленного анализа. Возникла необходимость найти рекомендацию, нормативно-правовой документ, форму, образец заполнения и т.п., — эксперт на связи. Отвечает на вопросы в режиме чата в течение 5-10 минут.
Экспертное заключение Ведущий специалист отдела налоговой безопасности проверяет контрагента в разрезе сделки. Вычитывает договор на налоговые риски и соответствие требованиям статьи 54.1 НК. Дает рекомендации, какие пункты договора скорректировать, чтобы обезопасить бухгалтера и компанию. Проверяет налоговую нагрузку контрагента, есть ли у него разрешение на тот вид деятельности по которому заключается договор, может ли контрагент с официальной среднесписочной численностью выполнить условия договора. Срок подготовки заключения 3 — 5 рабочих дней
	Попробовать	Купить	Купить

Как записаться на прием в налоговую инспекцию

]]>

Подборка наиболее важных документов по запросу Как записаться на прием в налоговую инспекцию (нормативно–правовые акты, формы, статьи, консультации экспертов и многое другое).

Судебная практика: Как записаться на прием в налоговую инспекцию Открыть документ в вашей системе КонсультантПлюс:
Подборка судебных решений за 2019 год: Статья 80 «Налоговая декларация, расчеты» НК РФ
(Юридическая компания «TAXOLOGY»)Налогоплательщик 9 и 25 января представил в налоговый орган по ТКС налоговые декларации и расчет по страховым взносам, подписанные генеральным директором. 29 января в ЕГРЮЛ была внесена запись о недостоверности сведений о юридическом лице в части сведений о генеральном директоре. Налоговый орган не принял направленные налогоплательщиком документы со ссылкой на отсутствие принадлежности электронной подписи подписанту. Суд признал отказ в принятии документов незаконным на основании абз. 2 п. 4 ст. 80 НК РФ, указав, что налоговый орган не вправе отказать в принятии налоговой декларации, представленной по установленной форме. Поскольку налоговым законодательством и административным регламентом, утвержденным Приказом Минфина России от 02.07.2012 N 99н, не предусмотрены полномочия налогового органа по оценке достоверности подписи лица на налоговой декларации, установлению реальности исполнения обязанностей руководителем юридического лица, а также в связи с тем, что на момент представления декларации в ЕГРЮЛ отсутствовала запись о недостоверности сведений, налоговый орган был обязан принять налоговые декларации и расчет по страховым взносам.

Статьи, комментарии, ответы на вопросы: Как записаться на прием в налоговую инспекцию Открыть документ в вашей системе КонсультантПлюс:
Статья: Новости от 02.08.2019
(«Главная книга», 2019, N 16)Кроме того, после обновления, воспользовавшись приложением, предприниматель может записаться на прием в ИФНС. Также ИП при помощи мобильного приложения может, например: Открыть документ в вашей системе КонсультантПлюс:
Статья: Тенденции и перспективы налогового администрирования в современных условиях
(Мамонова И.В.)
(«Налоги» (журнал), 2018, N 1)Второе направление налогового администрирования реализуется через сервисно-ориентированную модель, облегчающую информационное взаимодействие налогоплательщиков и налоговых органов. Прежде всего следует отметить насыщенный функционал сайта Федеральной налоговой службы, насчитывающий около 50 электронных сервисов, основанный на принципе экстерриториальности обслуживания и позволяющий налогоплательщикам и налоговым агентам совершать значительное количество действий без личного визита в налоговую инспекцию. При этом благодаря тщательно проработанному интерфейсу сайта, наличию видеоматериалов по различным вопросам, эффективно использовать его могут даже те лица, которые не имеют специального образования и навыков. Насыщенность информацией дает возможность налогоплательщикам без излишних финансовых, материальных и временных затрат проявлять должную осмотрительность (сервис «Риск бизнеса. Проверь себя и контрагента»), подтверждать достоверность персональных данных (сервис «Узнай ИНН»), наиболее оптимальным способом начать предпринимательскую деятельность (сервис «Создай свой бизнес»), осуществлять мониторинг жалоб, поданных в налоговые органы (сервис «Узнать о жалобе»), устанавливать реквизиты государственных органов (сервис «Адреса и платежные реквизиты вашей инспекции»), записываться на прием в налоговые органы (сервис «Онлайн запись на прием в инспекцию») и ряд других.

Нормативные акты: Как записаться на прием в налоговую инспекцию Приказ ФНС России от 08.07.2019 N ММВ-7-19/343@
«Об утверждении Административного регламента Федеральной налоговой службы по предоставлению государственной услуги по бесплатному информированию (в том числе в письменной форме) налогоплательщиков, плательщиков сборов, плательщиков страховых взносов и налоговых агентов о действующих налогах, сборах и страховых взносах, законодательстве о налогах и сборах и принятых в соответствии с ним нормативных правовых актах, порядке исчисления и уплаты налогов, сборов и страховых взносов, правах и обязанностях налогоплательщиков, плательщиков сборов, плательщиков страховых взносов и налоговых агентов, полномочиях налоговых органов и их должностных лиц, а также по приему налоговых деклараций (расчетов)»
(Зарегистрировано в Минюсте России 16.09.2019 N 55942)б) осуществления записи на прием в инспекции ФНС России для представления налоговых деклараций по налогу на доходы физических лиц;

ФНС России информирует » Официальный сайт городского округа Архангельской области «Мирный»

В России стартовала Декларационная кампания 2021 года

До 30 апреля 2021 года налогоплательщики обязаны представить декларацию о доходах, полученных в 2020 году. Сдать декларацию также должны индивидуальные предприниматели, нотариусы, занимающиеся частной практикой, адвокаты, учредившие адвокатские кабинеты и другие лица.

Межрайонная ИФНС России № 6 по Архангельской области и Ненецкому автономному округу напоминает, отчитаться о доходах должны следующие категории налогоплательщиков:

— нотариусы, адвокаты, другие лица, занимающиеся частной практикой;

— физические лица по вознаграждениям, полученным не от налоговых агентов;

— физические лица по суммам, полученным от продажи имущества, например, продал недвижимость, которая была в собственности меньше минимального срока владения;

— физические лица, резиденты РФ по доходам, полученным от источников, находящихся за пределами РФ;

— физические лица, по доходам, при получении которых не был удержан налог налоговыми агентами;

— физические лица, получающие выигрыши, выплачиваемые организаторами лотерей и других основанных на риске игр;

— физические лица, получающие доходы в виде вознаграждения, выплачиваемого им как наследникам авторов произведений науки, литературы, искусства, а также авторов изобретений;

— физические лица, получающие от физических лиц доходы в порядке дарения.

Сделать это можно в налоговой инспекции по месту своего учета или в многофункциональном центре предоставления государственных и муниципальных услуг. Заполнить декларацию также можно онлайн в Личном кабинете налогоплательщика для физических лиц, где большая часть данных уже предзаполнена, или использовать программу «Декларация», которая автоматически формирует нужные листы формы 3-НДФЛ.

Уплатить НДФЛ, исчисленный в декларации, необходимо до 15 июля 2021 года.

За нарушение сроков подачи декларации и уплаты НДФЛ налогоплательщика могут привлечь к ответственности в виде штрафа и пени.

Предельный срок подачи декларации 30 апреля 2021 года не распространяется на получение налоговых вычетов. В этом случае направить декларацию можно в любое время в течение года.

Недостоверность сведений в ЕГРЮЛ может привести к закрытию фирмы

Межрайонная ИФНС России № 6 по Архангельской области и Ненецкому автономному округу, обращает внимание руководителей и учредителей (участников) юридических лиц на необходимость регулярно проверять сведения о своих организациях, содержащиеся в Едином государственном реестре юридических лиц. Особого внимания заслуживают внесённые в ЕГРЮЛ записи о недостоверности сведений о юридическом лице (в отношении адреса, руководителя или участника (учредителя) организации и др.).

При выявлении регистрирующим органом (ИФНС России по г. Архангельску, осуществляющая функции Единого регистрационного центра на территории Архангельской области и Ненецкого автономного округа) фактов недостоверности сведений в ЕГРЮЛ (отсутствие организации по указанному в ЕГРЮЛ адресу, изменение состава участников общества, изменение сведений о руководителе), юридическому лицу направляется уведомление.

Если в течение 30 дней от компании не поступят достоверные сведения, либо документы, подтверждающие достоверность имеющихся сведений, в ЕГРЮЛ вносится запись о недостоверности. Через полгода после даты внесения записи регистрирующий орган вправе инициировать процедуру исключения организации из ЕГРЮЛ, то есть ликвидации.

Обязанность своевременно вносить изменения в сведения о юридическом лице, содержащиеся в ЕГРЮЛ, предусмотрена статьей 5 Федерального закона от 08.08.2001 № 129-ФЗ «О государственной регистрации юридических лиц и индивидуальных предпринимателей».

Для внесения таких изменений в регистрирующий орган представляется заявление по форме Р13014, утвержденной приказом ФНС России от 31.08.2020 № ЕД-7-14/617@. Возможность направления заявления в электронном формате реализована в сервисе на сайте ФНС России «Государственная регистрация юридических лиц и индивидуальных предпринимателей».

Наиболее удобный способ получения сведений из ЕГРЮЛ – онлайн-сервисы сайта ФНС России www.nalog.ru: «Прозрачный бизнес» и «Проверь себя и контрагента» (блок «Риски бизнеса»), а также «Предоставление сведений из ЕГРЮЛ/ЕГРИП в электронном виде» (блок «Сведения из реестров»).

Расчет по страховым взносам за 2020 год представляется по обновленной форме

С расчетного периода 2020 года расчеты по страховым взносам представляются плательщиками в налоговые органы по обновленной форме в соответствии с приказом ФНС России от 15.10.2020 № ЕД-7-11/751@.

Теперь в него включается информация о среднесписочной численности работников организации. Указанный показатель отражается на титульном листе расчета.

Плательщики, у которых число работников превышает 10 человек, направляют расчет по страховым взносам в электронной форме. Если же у компании 10 сотрудников и менее, она вправе представить указанный расчет как в электронной форме, так и на бумаге.

Отчетная кампания по приему расчетов по страховым взносам за 2020 год стартует 1 января 2021 года.

Как проверить Вашего контрагента, используя официальную базу ФНС РФ. — Юридическая Компания ЮСАКТУМ |

Главная задача Юридической Компании «Ваше Дело Правое» – предоставление качественных юридических услуг как юридическим лицам, так и физическим лицам, оказание надлежащей правовой помощи Клиенту, надёжная правовая и человеческая поддержка Клиента в трудных ситуациях. Обращение в нашу компанию даёт Вам больше шансов на положительное решение Вашего дела, на разрешение судебного (досудебного) спора, участником которого Вы являетесь, на решение Ваших проблем. В качестве правовых мер, которые снизят Ваши правовые и финансовые риски, рекомендуем воспользоваться комплексом услуг «Проверка контрагентов, анализ и мониторинг деятельности», предоставляемых нашей компанией. Обращение в нашу компанию даёт Вам больше шансов на положительное решение Вашего дела, на разрешение судебного (досудебного) спора, участником которого Вы являетесь, на решение иных Ваших проблем.

Проверка Вашего контрагента осуществляется выполнением нижеуказанных действий.

1. Печатаем сайт ФНС РФ: http://www.nalog.ru/ или в поисковике вводим: ФНС РФ.
2. Под названием «Федеральная налоговая служба» находим вкладку «Электронные услуги», нажимаем на эту вкладку.

 

1. После нажатия на вкладку «Электронные услуги» открывается следующая вкладка, выбираем 6 позицию, а именно: «Проверь себя и контрагента».

 

1. Открывается окно «Сведения, внесенные в Единый государственный реестр юридических лиц на …», вводим в верхнюю строчку ИНН (ОГРН) Вашего контрагента, вводим цифровой код и нажимаем «Искать».
2. Появляются сведения о контрагенте. Проверяем на предмет соответствия названия и места нахождения. Советуем скопировать ОГРН для дальнейшего использования.
3. Ниже кнопки «Искать» находится таблица «Проверьте, не рискует ли ваш бизнес?».
4. Поочередно нажимаем нижерасположенные вкладки (синим цветом).
5. Первая вкладка «Сведения о юридических лицах и индивидуальных предпринимателях, в отношении которых представлены документы для государственной регистрации» — вводим ОГРН (мы его заранее скопировали), нажимаем «Найти». В случае появления каких-либо изменений, смотрим их и дату появления. Если дата совсем недавняя, то рекомендуем запросить Вашего контрагента по поводу этих изменений. Например, о юридических лицах и индивидуальных предпринимателей.

 

Наименование: Открытое акционерное общество «ХХХ» ОГРН:1111111111111

Форма заявления: Р14001 Вид изменений: Вносимые в сведения реестра (форма № Р14001), в том числе в части: лица, имеющего право без доверенности действовать от имени юридического лица

Дата представления:25.05.2013 Способ представления: Лично Входящий номер: 111111А

Межрайонная ИФНС России № 46 по г.Москве

Вид решения: Решение о государственной регистрации. ГРН внесенной записи 1111111111111 Дата готовности документов: 05.06.2013

 

1. Делаем вывод: несколько месяцев назад прошла смена генерального директора Вашего контрагента. В этом случае необходимо запросить дополнительные сведения у Вашего контрагента.
2. Далее возвращаемся и нажимаем следующую синюю вкладку «Сообщения юридических лиц, опубликованные в журнале «Вестник государственной регистрации»». Вводим ОГРН и нажимаем «Искать». Появление записи «Публикации в журнале «Вестник государственной регистрации» НЕ ОБНАРУЖЕНО» является приемлемым признаком. В случае обнаружения какой-либо записи в отношении Вашего контрагента данный признак является опасным. В этом случае договор лучше на заключать.
3. Таким же образом проверяется следующая вкладка «Сведения о юридических лицах». Вводим ОГРН, нажимаем. Появление записи «Информации не обнаружено» является приемлемым признаком. Наличие какой-либо другой записи требует дополнительной проверки Вашего контрагента, до проведения такой проверки договор лучше не заключать.

Таким образом, используя официальный сайт ФНС РФ, можно получить предварительные сведения о Вашем контрагенте. Для получения более полной информации о Вашем контрагенте и мониторинге его деятельности рекомендуем использовать комплекс услуг «Проверка контрагентов, анализ и мониторинг деятельность», предоставляемых нашей компанией. Названный комплекс услуг в своей совокупности позволит нашему Клиенту:

— Осуществить проверку Вашего потенциального (или имеющегося) контрагента, действующего в любой сфере коммерческой деятельности.

— Получить информацию о текущем состоянии дел контрагента (справка о контрагенте, справка о бухгалтерском балансе контрагента, выписки из ЕГРЮЛ (ЕГРИП), правовое заключение и др.).

— Узнать, является ли контрагент стабильной и надёжной компанией (юридическим лицом или индивидуальным предпринимателем).

— Не скрывается ли контрагент от налоговых органов и своих партнёров, часто меняя свой юридический адрес, собственников, руководителей.

Наша компания стремится к максимально эффективному решению задач, поставленных нашими Клиентами, разрешению их проблем, используя все существующие правовые механизмы правовой системы. Мы готовы взять на себя ответственность за правовое решение Ваших проблем, обеспечить надёжную защиту Ваших прав и законных интересов. Мы гарантируем добросовестность и ответственность, максимальный учёт интересов Клиента, профессиональный подход, адекватные цены, конфиденциальность и надёжность. Мы готовы профессионально и эффективно защищать Ваши права и законные интересы. Опыт работы нашей компании позволяет нам утверждать, что так называемых «проигрышных» или «безнадёжных» дел не бывает. В любой ситуации для защиты Ваших прав и законных интересов можно что-то сделать, используя при этом не запрещённые действующим законодательством средства и методы, применив творческий подход, нестандартность мышления, высокий уровень профессиональных юридических знаний, выбирая наиболее оптимальные способы защиты интересов Клиента в целях достижения положительного результата.

Мы стараемся максимально учитывать интересы Клиента, минимизировать любые его расходы, индивидуально подходим к разрешению возникшей спорной ситуации.

Мы гарантируем добросовестность, ответственность, профессиональный индивидуальный подход к каждому Клиенту!

Научно-исследовательский семинар «Электронные сервисы ФНС России в помощь налогоплательщикам»

25 ноября 2016 года кафедрой бухгалтерского учета и аудита технолого-экономического института ФГБОУ ВО СПбГАУ под руководством д.э.н., профессора Бычковой Светланы Михайловны для магистрантов направления «Экономика» профиля «Бухгалтерский учет. Анализ. Аудит» был организован научно-исследовательский семинар на тему «Электронные сервисы ФНС России в помощь налогоплательщикам».

Докладчиком выступила сотрудник межрайонной ИФНС № 2 по Санкт-Петербургу – заместитель начальника отдела камеральных проверок № 3 З.В. Марченко.

В ходе семинара были рассмотрены следующие вопросы:

1. Электронные сервисы ФНС России для налогоплательщиков – физических лиц
2. Электронные сервисы ФНС России для налогоплательщиков – юридических лиц.

На семинаре был раскрыт вопрос по взаимодействию налогоплательщиков и налоговых органов с помощью ряда различных электронных сервисов ФНС России, представленных на сайте www.nalog.ru. При этом налогоплательщикам – физическим лицам (ФЛ), юридическим лицам (ЮЛ) и индивидуальным предпринимателям (ИП) могут быть полезны следующие электронные сервисы:

1) Личный кабинет налогоплательщика для физических лиц (ФЛ).

Сервис позволяет получать актуальную информацию о задолженности по налогам перед бюджетом, о суммах начисленных и уплаченных налоговых платежей, об объектах собственности, контролировать состояние расчетов с бюджетом, получать и распечатывать налоговые уведомления и квитанции на уплату налогов, осуществлять оплату, заполнять налоговую декларацию 3-НДФЛ в режиме онлайн, направлять декларацию 3-НДФЛ в налоговый орган, подписанную ЭП налогоплательщика, отслеживать статус камеральной проверки декларации 3-НДФЛ, обращаться в налоговые органы без личного визита.

2) Риски бизнеса: проверь себя и контрагента (ИП, ЮЛ).

Сервис позволяет проявить должную осмотрительность при выборе контрагента (поставщика, подрядчика), предоставляет сведения о государственной регистрации ЮЛ, ИП, крестьянских (фермерских) хозяйств, позволяет осуществлять поиск сведений в реестре дисквалифицированных лиц. Содержит информацию об адресах массовой регистрации; сведения о лицах, в отношении которых факт невозможности участия в организации установлен в судебном порядке, сведения о ЮЛ, отсутствующих по своему юридическому адресу.

3) Онлайн запись на прием в инспекцию (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис предоставляет возможность всем категориям налогоплательщиков записаться на прием в инспекцию на любую услугу, спланировав визит в инспекцию заранее.

4) Узнай ИНН (ИП, ФЛ).

Сервис позволяет узнать свой идентификационный номер налогоплательщика (ИНН), узнать ИНН физического лица.

5) Письма ФНС России, направленные в адрес территориальных налоговых органов (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис разъясняет налогоплательщикам и сотрудникам территориальных налоговых органов официальную позицию ФНС России о порядке заполнения налоговых деклараций, исчисления и уплаты налогов и сборов, согласованную с Минфином России.

6) Часто задаваемые вопросы (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис содержит базу ответов на самые актуальные вопросы налогоплательщиков: о действующем налоговом законодательстве, о порядке взаимодействия с налоговыми органами федерального, регионального и местного уровней.

7) Обратиться в ФНС России (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис является средством для обращений физических и юридических лиц в Федеральную налоговую службу. Обращения рассматриваются в соответствии с Федеральным законом от 02.05.2006 № 59-ФЗ «О порядке рассмотрения обращений граждан Российской Федерации»

8) Узнать о жалобе (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис предоставляет возможность организациям и физическим лицам получать информацию о ходе и результатах рассмотрения обращений (жалоб, заявлений, предложений), поступивших в Федеральную налоговую службу.

9) Решения по жалобам (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис предоставляет информацию о результатах рассмотрения ФНС России жалоб (обращений) налогоплательщиков за исключением информации, доступ к которой ограничен законодательством Российской Федерации.

10) Нормативные и методические материалы ФНС России (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис содержит нормативные и методические материалы ФНС России.

11) Анкетирование (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис предоставляет возможность оценить работу налоговых органов.

12) Почтовая рассылка сайта ФНС России (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет подписаться на рассылку обновлений сайта ФНС России из интересующего пользователя раздела.

13) Заплати налоги (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет налогоплательщикам формировать платежные документы и осуществлять оплату в режиме онлайн через один из банков-партнеров ФНС России.

14) Представление налоговой и бухгалтерской отчетности в электронном виде (ИП, ЮЛ).

Сервис позволяет направить в налоговый орган налоговую и бухгалтерскую отчетность в электронном виде.

15) Сервис получения идентификатора абонента (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Позволяет всем категориям налогоплательщиков, имеющим сертификат ключа электронной подписи, зарегистрироваться в системе сдачи налоговой и бухгалтерской отчётности по ТКС и получить идентификатор абонента.

16) Федеральная информационная адресная система (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет получить достоверную, единообразную, общедоступную, структурированную адресную информацию по территории Российской Федерации.

17) Доступ к ЕГРЮЛ и ЕГРИП (ИП, ЮЛ).

Сервис предоставляет возможность получения сведений из ЕГРЮЛ и ЕГРИП в электронном виде через Интернет. Начиная с 15 сентября 2015 года в сервисе также реализована возможность использования сведений из ЕГРЮЛ, ЕГРИП в информационных системах заинтересованных юридических и физических лиц

18) Форум сайта ФНС России (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис представляет собой площадку для обсуждения актуальных вопросов.

19) Узнай ОКТМО (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет определить код ОКТМО по коду ОКАТО или по наименованию муниципального образования.

20) Открытые и общедоступные сведения ЕГРН об иностранных организациях (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис предназначен для информирования о состоящих на учете в налоговых органах иностранных организациях либо об отсутствии в ЕГРН сведений о них.

21) Сообщение о клиенте — иностранном налогоплательщике (ЮЛ).

Данный сервис позволяет российской организации финансового рынка в связи с требованиями Федерального закона от 28.06.2014 №173-ФЗ сформировать и направить уведомления о своих клиентах-иностранных налогоплательщиках во все уполномоченные органы по принципу единого окна, а также получать изданные Росфинмониторингом решения о запрете на направление информации в иностранный налоговый орган.

22) Налоговый калькулятор — Расчет стоимости патента (ИП).

Сервис позволяет индивидуальным предпринимателям рассчитать сумму налога, уплачиваемого в связи с применением патентной системы налогообложения.

23) Вакансии (ФЛ).

Сервис предназначен для информирования о вакансиях ФНС России и территориальных налоговых органов.

24) Личный кабинет налогоплательщика юридического лица (ЮЛ).

Сервис позволяет получать актуальную информацию о задолженности по налогам перед бюджетом, о суммах начисленных и уплаченных налоговых платежей, о наличии переплат, невыясненных платежей; контролировать состояние расчетов с бюджетом; составлять и направлять в налоговые органы заявления на уточнение платежа, заявления о зачете/возврате переплаты; получать справки о состоянии расчетов с бюджетом, об исполнении обязанности по уплате налогов и других обязательных платежей, акты сверки.

25) Личный кабинет налогоплательщика индивидуального предпринимателя (ИП).

Сервис позволяет индивидуальному предпринимателю в режиме онлайн контролировать состояние расчетов с бюджетом, взаимодействовать с налоговыми органами в электронном виде, а также подбирать оптимальную систему налогообложения.

26) Единый реестр субъектов малого и среднего предпринимательства (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис предоставляет доступ к Единому реестру субъектов малого и среднего предпринимательства, позволяет в электронном виде направить в ФНС России дополнительные сведения для внесения в реестр.

27) Подача заявки на государственную регистрацию индивидуальных предпринимателей и юридических лиц (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет ФЛ направить заявку на государственную регистрацию в качестве ИП, на внесение изменений в сведения об ИП, на прекращение деятельности ИП; ЮЛ осуществить подготовку заявления о государственной регистрации при создании юридического лица и направить заявку на государственную регистрацию. При этом наличие ЭП не обязательно.

28) Создай свой бизнес (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис представляет собой пошаговую инструкцию для начинающих предпринимателей: выбор формы регистрации и режима налогообложения, осуществление государственной регистрации, правила применения контрольно-кассовой техники, информация о процедуре проведения налоговых проверок.

29) Подача электронных документов на государственную регистрацию юридических лиц и индивидуальных предпринимателей (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис предоставляет возможность направить пакет документов в налоговый орган при осуществлении государственной регистрации ЮЛ и ИП. Требуется наличие ЭП и установка специальной программы подготовки пакета документов.

30) Калькулятор транспортного налога ФЛ (ФЛ).

Сервис позволяет физическим лицам рассчитать сумму транспортного налога.

31) Подача заявления физического лица о постановке на учет (ФЛ).

Сервис позволяет: направить в налоговый орган заявление физического лица о постановке на учет (в том числе заверенное ЭП заявителя).

32) Калькулятор земельного налога и налога на имущество физических лиц, исчисляемых исходя из кадастровой стоимости (ФЛ).

Сервис позволяет рассчитать сумму земельного налога и налога на имущество физических лиц исходя из кадастровой стоимости.

33) Адрес и платежные реквизиты Вашей инспекции (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет по заданному адресу узнать номер, адрес и реквизиты налоговой инспекции.

34) Справочная информация о ставках и льготах по имущественным налогам (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет получить информацию по вопросам применения налоговых ставок и льгот по налогу на имущество, транспортному и земельному налогам.

35) Заполнить платежное поручение (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет подготовить платежные документы на перечисление налогов, сборов и иных платежей в бюджетную систему Российской Федерации в электронном виде.

36) Реестр аккредитованных филиалов, представительств иностранных юридических лиц (РАФП) (ЮЛ).

Сервис предоставляет возможность бесплатно получить открытые и общедоступные сведения государственного реестра аккредитованных филиалов, представительств иностранных юридических лиц (РАФП).

37) Уплата госпошлины (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет сформировать платежный документ на уплату госпошлины при регистрации ЮЛ/ИП, за предоставление сведений из ЕГРЮЛ/ЕГРИП/ЕГРН и реестра дисквалифицированных лиц, а также произвести онлайн оплату через один из банков-партнеров ФНС России.

38) Предоставление сведений из ЕГРЮЛ/ЕГРИП о конкретном юридическом лице/индивидуальном предпринимателе в форме электронного документа (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис предоставляет возможность бесплатно получить сведения из ЕГРЮЛ / ЕГРИП о конкретном юридическом лице / индивидуальном предпринимателе в форме электронного документа, подписанного электронной подписью. Данный сервис является модернизацией сервиса «Получение выписки из ЕГРЮЛ/ЕГРИП через интернет».

39) Представление сведений об участниках азартных игр, от которых принимаются ставки на официальные спортивные мероприятия (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет организаторам азартных игр в букмекерских конторах и тотализаторах представлять в Федеральную налоговую службу данные учета участников азартных игр, от которых принимаются ставки на официальные спортивные соревнования.

40) ЕАЭС. Заявления о ввозе товаров и уплате косвенных налогов (ИП, ЮЛ).

Сервис позволяет получить информацию о поступлении электронной копии заявления о ввозе товаров и уплате косвенных налогов из налоговых органов страны импортёра (заявителя) в налоговые органы страны-экспортёра Таможенного союза.

41) Проверка корректности заполнения счетов-фактур (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет проверить правильность заполнения идентификационных реквизитов контрагентов в счетах-фактурах.  Сервис функционирует в рамках пилотного проекта!

42) Информационные стенды (ИП, ЮЛ, ФЛ).

Сервис позволяет налогоплательщику получить всю информацию, размещенную на информационных стендах территориальных налоговых органов в режиме онлайн, без личного посещения инспекции.

43) Налоговый калькулятор по расчету налоговой нагрузки (ЮЛ).

Региональный сервис позволяет налогоплательщикам Санкт-Петербурга самостоятельно оценить и предупредить налоговые риски.

Также на сайте ФНС России можно узнать информацию о действительных и недействительных свидетельствах о постановке на учет в налоговых органах.

Самым популярным сервисом среди физических лиц является личный кабинет, т.к. с его помощью можно оперативно отслеживать информацию о задолженности по уплате различных налогов, заполнить декларацию для получения налогового вычета и т.д.

В конце семинара присутствующим был представлен видеоролик на тему: «Личный кабинет налогоплательщика для физических лиц». (https://www.nalog.ru/rn78/fl/4816681/).

Вопросы присутствующих:

1. Как можно устроиться работать в ФНС России?
2. Можно ли получить пароль для регистрации личного кабинета без явки налоговую инспекцию? Например через портал «Госуслуги»?

Итог семинара: обучающиеся, в том числе магистранты направления «Экономика» профиля «Бухгалтерский учет. Анализ. Аудит», и преподаватели проинформированы о возможностях использования электронных сервисов ФНС России для налогоплательщиков – физических и юридических лиц.

Всего в семинаре приняли участие более 30 слушателей, в том числе 26 магистрантов ФГБОУ ВО СПбГАУ. 

Межрайонная ИФНС России № 10 по Кировской области сообщает

1. Межрайонная ИФНС России № 10 по Кировской области сообщает о новых функциональных возможностях сервиса ФНС России «Риски бизнеса: проверь себя и контрагента» и прикладной подсистемы «Удаленный доступ к данным аналитического сегмента федерального хранилища данных» утвержденного приказом ФНС России от 01.07.2015 №ММВ-7−6/261@ «О вводе в промышленную эксплуатацию программного обеспечения, реализующего формирование и предоставление сведений о физических лицах, являющихся руководителями или учредителями нескольких юридических лиц». Помимо того, что Сервис позволяет проявить должную осмотрительность при выборе контрагента (поставщика, подрядчика), предоставляет сведения о государственной регистрации ЮЛ, ИП, крестьянских (фермерских) хозяйств, позволяет осуществлять поиск сведений в реестре дисквалифицированных лиц. Содержит информацию об адресах массовой регистрации; сведения о лицах, в отношении которых факт невозможности участия в организации установлен в судебном порядке, сведения о ЮЛ, отсутствующих по своему юридическому адресу, так и позволяет проявить должную осмотрительность при выборе компаньона по бизнесу проверив его на массовость участия в нескольких юридических лицах с помощью сервиса «Риски бизнеса: проверь себя и контрагента» / сведения о физических лицах, являющихся руководителями или учредителями (участниками) нескольких юридических лиц. Для поиска сведений необходимо выбрать признак ФЛ «Руководитель» или «Учредитель» и внести ФИО предполагаемого ФЛ при наличии указать его ИНН, после чего на экране появится информация об участии этого ФЛ в тех или иных юридических лицах.
2. Межрайонная ИФНС России № 10 по Кировской области сообщает о функциональных возможностях сервиса ФНС России «Предоставление сведений из ЕГРЮЛ/ЕГРИП о конкретном юридическом лице / индивидуальном предпринимателе в форме электронного документа» утвержденного приказом ФНС России от 24.06.2015 №ММВ-7−6/255@ «О вводе в промышленную эксплуатацию модернизированного программного обеспечения, реализующего предоставление сведений из ЕГРЮЛ/ЕГРИП о конкретном юридическом лице / индивидуальном предпринимателе в форме электронного документа» Данный Сервис предоставляет возможность заинтересованным лицам бесплатно получить сведения из ЕГРЮЛ/ЕГРИП о конкретном юридическом лице/индивидуальном предпринимателе в виде выписки/справки об отсутствии запрашиваемой информации в форме электронного документа, подписанного электронной подписью. Для получения выписки сертификат ключа электронной подписи заявителя не требуется. Сформированную выписку/справку можно скачать в течение пяти дней. Выписка/справка формируется в формате PDF. При открытии PDF-документа, подписанного электронной подписью, с помощью Adobe Reader без выполнения необходимых для проверки электронной подписи настроек программного обеспечения, появляется сообщение о недействительности подписи. Внимание! Данный сервис является модернизацией сервиса «Получение выписки из ЕГРЮЛ/ЕГРИП через Интернет» в связи с внесением изменений в пункт 1 статьи 7 Федерального закона от 8 августа 2001 г. № 129-ФЗ «О государственной регистрации юридических лиц и индивидуальных предпринимателей», предусматривающих что предоставление содержащихся в ЕГРЮЛ/ЕГРИП сведений о конкретном юридическом лице/индивидуальном предпринимателе в форме электронного документа осуществляется бесплатно.

И.о. начальника инспекции,

советник государственной гражданской

службы Российской Федерации 2 класса Д.В. Суходоев

This entry was posted in Новости on 25.07.2015 by Виктор Шутов.

Бычий IFN-альфа-A, самостоятельный ELISA, ≤10 планшетов

Размещение заказов
Нам требуются номер телефона и адрес электронной почты как для конечного пользователя заказанного продукта, так и для представителя вашей организации по работе с кредиторской задолженностью. Эта информация используется только для решения технических проблем и вопросов, связанных с выставлением счетов.

По телефону
Пожалуйста, позвоните нам по телефону 651-646-0089 с 8:30 до 17:30. CST пн — пт.

По факсу
Заказы можно отправлять по факсу 24 часа в сутки по номеру 651-646-0095.

По электронной почте
Отправляйте заказы по электронной почте [email protected].

По почте
Отправьте свой заказ по адресу:
Запись заказа на продажу
Kingfisher Biotech, Inc.
1000 Вестгейт Драйв
Люкс 123
Сент-Пол, MN 55114
США

Гарантия на продукцию
Компания Kingfisher Biotech, Inc. гарантирует, что продукты марки Kingfisher Biotech соответствуют заявленным спецификациям и описаниям на этикетках при использовании, обращении и хранении в соответствии с инструкциями.Если не указано иное, эта гарантия ограничена одним годом с даты продажи. Единственная ответственность Kingfisher Biotech за продукт ограничивается заменой продукта или возмещением покупной цены. Продукция марки Kingfisher Biotech предназначена для исследовательских целей. Они не предназначены для использования в медицинских, диагностических или терапевтических целях. Продукты нельзя перепродавать, модифицировать для перепродажи или использовать для производства коммерческих продуктов без предварительного письменного разрешения Kingfisher Biotech.

Условия оплаты
Все цены могут быть изменены без предварительного уведомления.Срок оплаты составляет 30 (тридцать) дней с момента получения счета. Плата за обслуживание в размере 1,5% в месяц добавляется к счетам, просроченным более 30 дней. Цены указаны в долларах США. Покупатель принимает на себя ответственность по уплате всех применимых налогов. С вас будет взиматься плата только за отгруженные товары. Товары, размещенные на обратном заказе, будут оплачиваться при отгрузке. Если вы разместите заказ и не выполните условия оплаты, Kingfisher Biotech, Inc. может без ущерба для любого другого законного средства защиты отложить дальнейшие поставки и / или отменить любой заказ.Вы несете ответственность перед Kingfisher Biotech, Inc. за все расходы и сборы, включая гонорары адвокатам, которые Kingfisher Biotech, Inc. может разумно понести при любых действиях по взысканию с вашего просроченного счета. Kingfisher Biotech, Inc. не соглашается и не связана какими-либо другими положениями или условиями, такими как условия заказа на поставку, которые не были прямо согласованы в письменной форме и подписаны должным образом уполномоченным должностным лицом Kingfisher Biotech, Inc.

Доставка
Стоимость доставки и погрузочно-разгрузочных работ оплачивается заранее и добавляется к счету.Затраты на доставку и транспортировку будут начислены только на первую отгрузку в ситуациях, когда заказ содержит обратно заказанные товары. Kingfisher Biotech, Inc. оставляет за собой право выбрать упаковку и способ доставки для вашего заказа, которые обеспечат стабильность продукта, а также эффективное отслеживание. Внутренние заказы обычно доставляются в ночное время. На повреждения во время транспортировки распространяется гарантия, предусмотренная настоящими условиями. Для международных заказов право собственности на товары переходит в Соединенных Штатах, когда товары размещены у грузоотправителя.Для всех заказов риск потери товара переходит, когда товар размещен у отправителя.

Возврат
Пожалуйста, позвоните в службу поддержки клиентов перед возвратом любых продуктов для возврата, кредита или замены. Никакие возвраты не принимаются без предварительного письменного разрешения. При возврате взимается комиссия за возврат в размере 20%.

Ваш путеводитель по интерферонам

Интерфероны — это белки, которые являются частью вашей естественной защиты. Они сообщают вашей иммунной системе, что в вашем теле есть микробы или раковые клетки.И они запускают убийственные иммунные клетки для борьбы с захватчиками.

Интерфероны получили свое название, потому что они «мешают» вирусам размножаться.

В 1986 году был создан первый лабораторный интерферон для лечения определенных типов рака. Это был один из первых методов лечения иммунной системы в борьбе с болезнями, который позже был одобрен для лечения ряда других заболеваний, включая гепатит и рассеянный склероз.

Как они работают?

Практически каждая клетка вашего тела вырабатывает интерфероны.Существует три основных типа:

• Интерферон-альфа (или интерферон-альфа)
• Интерферон-бета
• Интерферон-гамма

Клетки, инфицированные вирусами или другими микробами, выделяют интерферон-альфа и интерферон-бета. как предупреждающий сигнал для вашей иммунной системы. Это заставляет иммунные клетки, называемые лейкоцитами, выделять гамма-интерферон для борьбы с микробами.

Интерфероны действуют по-разному. Они:

• Предупредить вашу иммунную систему, чтобы она могла атаковать вирус или рак
• Помогите вашей иммунной системе распознать вирус или рак
• Сообщите иммунным клеткам атаковать
• Остановить рост и деление вируса и раковых клеток
• Помощь здоровые клетки борются с инфекцией

Какие состояния лечат интерфероны?

Интерферон-альфа лечит вирусные инфекции, в том числе:

• Хронический гепатит С, волосатоклеточный лейкоз, саркома Капоши, вызванная СПИДом, хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ)
• Хронический гепатит, лимфома и злокачественная меланома
• 70 Остроконечные кондиломы
• 70 Остроконечные кондиломы

  Но интерфероны не так часто используются для лечения этих заболеваний; появились новые лекарства, которые работают лучше и быстрее.

  Вдыхаемый интерферон-бета изучается, чтобы увидеть, может ли он помочь в лечении инфекции COVID-19.

  Интерферон-бета лечит различные типы рассеянного склероза. Он снимает воспаление в головном и спинном мозге, предотвращая повреждение нервов.

  Интерферон гамма-1b (Actimmune) лечит хроническую гранулематозную болезнь, которая влияет на работу вашей иммунной системы, и тяжелый злокачественный остеопетроз, поражающий ваши кости.

  К некоторым типам препаратов интерферона добавлено химическое вещество, называемое полиэтиленгликолем (ПЭГ).PEG продлевает действие лекарства в вашем теле, поэтому вам не нужно так много уколов. Это препараты пегинтерферона.

  Как принимать интерфероны?

  Вы получаете интерферон в виде укола под кожу или в мышцу. Врач может сделать вам прививку или научить делать ее самостоятельно дома. Иногда интерферон вводят через вену на руке (инфузия).

  Количество необходимых вам инъекций или инфузий зависит от вашего состояния. Уколы часто делают три раза в неделю, но для лечения рака вы можете получать настой 5 дней в неделю в течение нескольких недель или месяцев.

  Какие преимущества?

  Интерфероны — это искусственные версии белков, которые вырабатывает ваше тело. Эти препараты работают с вашей иммунной системой, помогая ей находить вирусы и рак и бороться с ними. Они могут остановить рост и распространение вируса и раковых клеток, а также предотвратить заражение других клеток.

  Если у вас рассеянный склероз, они могут снизить вероятность обострения и замедлить повреждение головного и спинного мозга.

  Какие риски?

  Интерфероны могут вызывать некоторые проблемы со здоровьем, в том числе:

  Проблемы с сердцем. У небольшого числа людей, получающих лечение интерферонами, может быть учащенное или нерегулярное сердцебиение или низкое кровяное давление.

  Психические расстройства. Некоторые люди говорят, что чувствуют депрессию или думают о самоубийстве, принимая интерферон. Если у вас депрессия или другое психическое расстройство, вашему врачу может потребоваться более пристальное наблюдение, пока вы принимаете один из этих препаратов.

  Болезнь глаз. Интерфероны могут усугубить некоторые глазные заболевания. Перед тем, как начать принимать эти препараты, каждому следует пройти проверку зрения.Людям с такими заболеваниями, как диабетическая ретинопатия, необходимо будет регулярно проходить обследование зрения во время лечения интерферонами.

  Заболевание щитовидной железы. В редких случаях интерфероны могут вызывать гиперактивность щитовидной железы (гипертиреоз) или недостаточную активность (гипотиреоз). Если у вас заболевание щитовидной железы, которое не контролируется лекарствами, вы не сможете принимать интерферон. Перед началом лечения врач проверит уровень гормонов щитовидной железы.

  Болезнь легких. Интерфероны иногда могут усугубить проблемы с легкими, такие как одышка, пневмония и бронхит. При приеме этих препаратов врач должен внимательно наблюдать за людьми с заболеваниями легких. Если у вас есть такие симптомы, как кашель или одышка, вам может потребоваться прекратить прием этого лекарства.

  Каковы побочные эффекты?

  Общие побочные эффекты интерферонов включают:

  • Боль, покраснение и отек в месте укола
  • Гриппоподобные симптомы
  • Усталость
  • Лихорадка
  • Озноб
  • Мышечная боль
  • Боль в пояснице
  • Сустав боль
  • Головная боль
  • Потеря аппетита
  • Потеря веса
  • Тошнота, рвота
  • Головокружение
  • Нервозность
  • Выпадение волос
  • Более высокая вероятность заражения
  • Слабость
  • Бледная кожа
  • Более легкие синяки или кровотечения, чем обычно
  • Одышка
  • Диарея
  • Проблемы со сном
  • Сыпь
  • Депрессия
  • Путаница

  Некоторые из этих побочных эффектов, включая симптомы гриппа, проходят в течение нескольких часов после инъекции.

  Эти побочные эффекты встречаются реже:

  • Боль в груди
  • Сыпь
  • Проблемы с печенью
  • Изменение вкуса
  • Боль в животе
  • Проблемы с беременностью
  • Утрата полового влечения
  • Отсутствие месячных
  • Жажда
  • Сухость во рту
  • Запор
  • Распухшие железы
  • Покраснение кожи
  • Потоотделение

  Эти побочные эффекты встречаются редко:

  • Дрожание
  • Ощущение иголки и иголки

  Кому нельзя их принимать?

  Интерфероны могут быть небезопасными для определенных групп людей.

  Беременные и кормящие женщины. Интерфероны могут нанести вред нерожденному ребенку. Важно не забеременеть во время приема этого препарата и в течение как минимум 6 месяцев после завершения лечения. Ваш врач может порекомендовать вам пройти тест на беременность, прежде чем вы начнете принимать интерфероны, и использовать средства защиты, такие как презервативы, пока вы их принимаете. Интерферон может попасть в грудное молоко, поэтому не кормите грудью, пока принимаете его.

  Мужчины, пытающиеся забеременеть от партнера . Эти препараты могут вызвать врожденные дефекты, если отец принимает их, когда их партнерша беременеет. Вы не должны становиться отцом ребенка в течение как минимум 6 месяцев после окончания лечения.

  О чем еще следует подумать?

  Интерфероны иногда могут влиять на действие других лекарств. Расскажите своему врачу обо всех других лекарствах, которые вы принимаете, включая витамины, добавки и лекарства, которые вы купили без рецепта без рецепта, перед тем, как начать это лечение.

  Поговорите со своим врачом о том, сколько времени вам следует подождать, прежде чем делать какие-либо живые вакцины, например, против ветряной оспы или кори, эпидемического паротита и краснухи (MMR).Это живые, но ослабленные формы болезни. Поскольку интерферон влияет на вашу иммунную систему, он может повысить риск заболевания болезнями, которые эти вакцины должны предотвращать.

  67 вопросов с ответами в ИНТЕРФЕРОН-ГАММА

  Уважаемый Хелми,

  Я считаю, что, задавая этот вопрос, вы косвенно имеете в виду чувствительность и специфичность IGRA как инструмента для выявления туберкулеза. Положительный тест IGRA может предложить три вещи: 1) латентный туберкулез 2) активный туберкулез 3) недавний контакт с туберкулезом .Те же правила применяются к тестам Манту, хотя они сложны и часто зависят от читателя / оператора.

  Показания IGRA также могут варьироваться в зависимости от испытуемых: люди с ослабленным иммунитетом могут не иметь достаточной иммунной реакции, чтобы дать некоторую форму конкретных показаний. Следовательно, чувствительность / специфичность IGRA ситуативна.

  Таким образом, ответ на ваш вопрос будет напрямую связан с ситуацией, в которой вы проводите свой тест. Обязательно обратитесь к следующим номерам:

  Diel R, Loddenkemper R, Nienhaus A.Доказательное сравнение

  коммерческих анализов высвобождения интерферона-γ для выявления активного ТБ. Комод

  2010; 137: 952-68.

  Lee JY, Choi HJ, Park IN, et al. Сравнение двух коммерческих тестов интерферона —

  γ для диагностики инфекции Mycobacterium tuberculosis. Eur

  Respir J 2006; 28: 24–30.

  Beglinger C, Dudler J, Mottet C, et al. Скрининг на туберкулезную инфекцию

  до начала терапии анти-TNF-α.Swiss Med Weekly 2007; 137: 621-

  22.

  Piana F, Codecasa R, Cavallerio P и др. Использование теста на основе Т-клеток для

  выявления туберкулезной инфекции среди пациентов с ослабленным иммунитетом.

  Европейский респираторный журнал, 2006 г .; 28 (1): 31-4.

  Piana F, Codecasa LR, Baldan R и др. Использование T-SPOT.TB в латентной диагностике туберкулезной инфекции

  в целом и иммуносупрессии

  популяций.New Microbiologica 2007; 30: 286-90.

  Brock I, Ruhwald M, Lundgren B, Westh H, Mathiesen LR, Ravn P. Латентный

  туберкулез у ВИЧ-положительных, диагностированный M. Tuberculosis Specific

  Интерферон-γ-тест. Респираторные исследования 2006; 7 (56): 1-6.

  Richeldi L. Обновленная информация о диагностике туберкулезной инфекции. Am J

  Respir Crit Care Med 2006; 174: 736–42.

  Надеюсь, это поможет.

  Рабин

  Границы | Ближний ранний белок ICP27 вируса простого герпеса 2 типа ингибирует продукцию IFN-β в эпителиальных клетках слизистой оболочки путем антагонизма активации IRF3

  Введение

  Вирус простого герпеса типа 2 (HSV-2) представляет собой крупный вирус дцДНК, принадлежащий к подсемейству α-Herpesviridae (1). ВПГ-2 в основном передается через слизистую оболочку половых органов половым путем, вызывая везикулы и язвы после острой инфекции, и может переноситься в ганглии дорзального корешка или черепных нервов для установления латентного периода на всю жизнь (2, 3).Согласно отчету ВОЗ, по оценкам, более 400 миллионов человек были инфицированы ВПГ-2, и в 2012 году во всем мире произошло 19,2 миллиона новых инфекций (4). Из-за большей и более хрупкой поверхности женских половых путей риск заражения ВПГ-2 у женщин выше, чем у мужчин (5). Эпидемиологические исследования показали, что инфекция ВПГ-2 может увеличивать риск заражения ВИЧ-1 в 3–4 раза (6), при этом предлагается несколько механизмов этой повышенной восприимчивости.Например, хотя HSV-2 может инфицировать эпителиальные клетки кожи, иммунные клетки и нервные клетки, он первоначально инфицирует эпителиальные клетки слизистой оболочки во время передачи половым путем (7), что может способствовать передаче ВИЧ-1 через нарушение целостности эпителия. Из-за высокой частоты инфицирования ВПГ-2 и общих путей передачи ВИЧ-1 инфекция слизистой оболочки ВПГ-2 и ускользание от иммунной системы привлекают повышенное внимание.

  Вирусная инфекция первоначально активирует врожденный иммунитет через распознавание рецепторами распознавания образов хозяина (PRR), включая Toll-подобные рецепторы (TLR), RIG-I-подобные рецепторы (RLR) и сенсоры ДНК (8–10).Эти PRR активируют нижестоящие сигнальные пути с использованием общих компонентов TBK-1 и IKK-ε, что приводит к активации передачи сигналов IRF3 (11). IRF3 является важным фактором транскрипции, который регулирует экспрессию интерферонов типа I (IFN) и IFN-стимулирующих генов (ISG). IRF3 существует в большинстве клеток как неактивный мономер. После активации IRF3 фосфорилируется и собирается в димеры, а затем перемещается в ядро ​​для инициации транскрипции IFN-β (12). IFN типа I обычно экспрессируются на низких уровнях, и их экспрессия может быть усилена посредством сигнального пути JAK / STAT во время вирусных или бактериальных инфекций, что приводит к активации транскрипции ISG (13).Семейство IFN типа I состоит из IFN-α, IFN-β, IFN-ε, IFN-κ и IFN-ω (14), причем IFN-β наиболее интенсивно исследуется в области противовирусного врожденного иммунитета (15).

  Во время инфекции HSV-2 индукция IFN типа I чрезвычайно низка (16), что позволяет предположить, что HSV-2 разработал стратегии противодействия продукции IFN. Однако наше текущее понимание иммунного уклонения от ВПГ-2 ограничено, в то время как большое количество исследований, посвященных ВПГ-1, указывает на участие множества контрмер в подрыве выработки интерферона I типа (17, 18).Учитывая, что в большинстве этих исследований рассматривается вопрос о том, как белки HSV-1 влияют на продукцию и / или передачу сигналов IFN, с использованием различных клеточных линий в качестве моделей (17), остается ли и как влияет на индукцию IFN в контексте вирусной инфекции на тканевом уровне. неуловимый. Известно, что HSV-2 и HSV-1 проявляют существенные различия в латентном периоде и паттернах реактивации (19), подразумевая, что они могут использовать разные механизмы для противодействия врожденному иммунитету хозяина. Предыдущие исследования других авторов показали, что белок UL41 вириона HSV-2 подавляет экспрессию IFN-β в генитальных эпителиальных клетках человека (20), тогда как HSV-2 US2 активирует NF-κB путем связывания с TAK1 (21).Наше предыдущее исследование показало, что немедленный ранний белок (IE) HSV-2, ICP22 (US1), ингибирует продукцию IFN-β, противодействуя ассоциации IRF3 с промотором IFN-β (22). Тем не менее, мы наблюдали, что ICP22-нулевой HSV-2 не полностью теряет ингибирующую активность при индукции IFN-β, в то время как другие белки IE, включая ICP27 (UL54), также, по-видимому, ингибируют активацию промотора IFN-β, хотя лежащий в основе механизм еще предстоит полностью решить.

  Наше текущее исследование было сосредоточено на том, подавляют ли и каким образом HSV-2 и его IE-белок ICP27 продукцию IFN-β в эпителиальных клетках слизистой оболочки.Мы обнаружили, что HSV-2 может ингибировать индукцию IFN-β в тканях шейки матки человека. Мы также обнаружили, что HSV-2 ICP27 значительно подавляет продукцию IFN-β, вызванную вирусом Сендай или полиинозиновой-полицитидиловой кислотой, в эпителиальных клетках слизистой оболочки человека. Механически мы продемонстрировали, что HSV-2 ICP27 напрямую связывается с IRF3 и ингибирует его фосфорилирование и ядерную транслокацию, что приводит к ингибированию индукции IFN-β.

  Материалы и методы

  Клеточные линии и вирусы

  Клетки

  HEK 293T, HeLa и ME180 культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (Hyclone), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Gibico), 100 Ед / мл пенициллина и 100 Ед / мл стрептомицина (Genom ).Все клетки культивировали при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO ₂ .

  HSV-2 (штамм G) был получен из стандартов LGC и размножен в клетках Vero. Вирус Сендай (SeV) размножали в яйцах с зародышами. Специальные свободные от патогенов яйца с эмбрионами (Beijing Merial Vital Laboratory Animal Technology Corporation) инкубировали при 37 ° C в течение 12 дней перед инокуляцией 300 мкл 100 HAU мл ^-1 SeV в аллантоисную полость яиц с 12-дневным эмбрионом и затем инкубировали при 37 ° C в течение 72 часов.SeV собирали из аллантоисных жидкостей, и титры измеряли с помощью анализа гемагглютинации (HA) с использованием куриных эритроцитов.

  Выделение первичных эпителиальных клеток слизистой оболочки человека

  Все протоколы с участием людей были рассмотрены и одобрены местным комитетом по этике исследований Уханьского института вирусологии Китайской академии наук. В этом исследовании было получено информированное письменное согласие участников исследования и письменное согласие родителей для всех участников в возрасте до 16 лет.

  Ткани шейки матки или крайней плоти человека были получены из Уханьской детской больницы (Уханьская больница по охране здоровья матери и ребенка), Медицинского колледжа Тунцзи, Университета науки и технологий Хуачжун. Ткани осторожно промывали PBS, а затем измельчали ​​на мелкие кусочки. Подготовленные кусочки ткани инкубировали с 5-10 мл раствора Dispase II (25 U / мл Dispase II в PBS pH 7,4 без Ca / Mg), содержащего пенициллин и стрептомицин. Затем добавляли 10% FBS, чтобы избежать чрезмерного повреждения клеток.После инкубации при 4 ° C в течение ночи отслоившийся эпидермис промывали PBS и помещали в 3–5 мл 0,05% трипсина с ЭДТА в коническую пробирку на 50 мл. После инкубации на водяной бане при 37 ° C в течение 15–30 минут с перемешиванием каждые 5 минут добавляли удвоенный объем среды EDTA с 10% FBS. Клетки эпидермиса высвобождались путем нескольких переворачиваний пробирки или пипетирования суспензии. Раствор клетки / ткани пропускали через стерильное сито с последующим центрифугированием. Осадки клеток ресуспендировали в среде EpiLife, и изолированные эпителиальные клетки культивировали в 12-луночных планшетах при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO ₂ .

  Конструирование плазмид

  Праймеры

  , используемые для конструирования плазмид, перечислены в дополнительной таблице 1. Открытая рамка считывания (ORF) HSV-2 ICP27 была амплифицирована из геномной ДНК HSV-2, экстрагированной из штамма HSV-2 G с помощью ПЦР. Для некоторых конструкций N-концевой флаг или HA вводили с помощью ПЦР. Продукты ПЦР клонировали в pcDNA3.1 (+) / (-) (Invitrogen), и сконструированные экспрессионные плазмиды были названы ICP27, ICP27-Flag, ICP27-HA, ICP27 _(1−138aa) , ICP27 _{(1− 152aa)} и ICP27 _(1−302aa) соответственно.Все конструкции были проверены секвенированием ДНК (Sunny Biotechnology). Репортерная плазмида PRD (III-I) ₄ -Luc была предоставлена ​​доктором Стефаном Людвигом (Университет Мюнстера, Мюнстер, Германия). Репортерная плазмида p125-Luc и плазмида внутреннего контроля phRL-TK были описаны ранее (23). Плазмиды экспрессии IRF3 и IRF3-5D pIRES-hrGFP / IRF3-Flag и pIRES-hrGFP / IRF3-5D-Flag (конститутивно активный мутант IRF3) были предоставлены доктором Илин Линь (Институт наук о жизни, Медицинский центр национальной обороны, Тайвань, Китай).Экспрессионная плазмида pEF-Flag-RIG-IN (усеченный на карбокси-конце, конститутивно активный мутант RIG-I) была предоставлена ​​доктором Такаши Фудзита (Университет Киото, Киото, Япония). Плазмида экспрессии pcDNA3-MAVS-Flag была предоставлена ​​доктором Hanzhong Wang (Институт вирусологии Ухань, Ухань, Китай). Плазмиды экспрессии pcDNA3-TBK1-Flag и pcDNA3-IKKε-Flag были предоставлены доктором Кэтрин Фицджеральд (Медицинская школа Массачусетского университета, Вустер, Массачусетс). Плазмиды, кодирующие вирус гриппа PR8 / NS1 и HSV-2 ICP22, соответственно, были описаны ранее (22).

  Анализ двойного отчета люциферазы (DLR)

  Клетки HEK 293T высевали в 24-луночные планшеты в течение ночи и котрансфицировали пустым вектором или плазмидой, кодирующей HSV-2 ICP27, усеченным HSV-2 ICP27 или вирусом гриппа NS1, репортерной плазмидой p125-Luc или PRD (III-I) ₄ -Luc и внутренний контроль phRL-TK. Трансфекцию проводили с использованием липофектамина 2000 (Life Technology, 11668019) в соответствии с инструкциями производителя. Через 24 часа после трансфекции клетки стимулировали 100 HAU мл ^-1 SeV или без них в течение 16 часов.Клетки собирали и лизировали, а лизаты использовали для измерения активности люциферазы светлячков и Renilla с использованием системы анализа репортеров с двойной люциферазой (Promega, E1980) в соответствии с инструкциями производителя. Для некоторых экспериментов клетки HEK 293T котрансфицировали пустым вектором или плазмидой экспрессии ICP27, репортерной плазмидой p125-Luc и phRL-TK внутреннего контроля вместе с плазмидой, кодирующей индуктор пути IRF3 RIG-IN, MAVS, TBK-1, IKK. -ε или IRF3-5D. Через 40 часов после трансфекции измеряли ферментативную активность люциферазы светлячка и Renilla.

  Анализ иммуноблоттинга

  Белки, экстрагированные из трансфицированных или инфицированных клеток, получали с использованием буфера для лизиса Pierce ™ IP (ThermoFisher Scientific, 87787) с добавлением белкового ингибитора (cOmplete Protease Inhibitor Cocktail, 11697498001). Образцы белка разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на PVDF-мембраны (0,45 мкм, Millipore). Цитоплазматические и ядерные белки выделяли с использованием набора для экстракции ядерного цитозоля (Applygen, P1200-50).

  Антитело (Ab) против HSV-1 ICP27 + HSV-2 ICP27 было приобретено у Abcam (ab31631).Кроличьи поликлональные антитела против IRF3, кроличьи антитела против PCNA и мышиные mAb против HA-tag были приобретены у Proteintech (11312-1-AP, 10205-2-AP и 66006-1-Ig). Кроличьи mAb против фосфо-IRF-3 (Ser396) были приобретены в Cell Signaling Technology (4947S). Кроличьи mAb против HA-tag и мышиные mAb против Flag-tag были приобретены у Sigma-Aldrich (H6908 и F1804). Мышиные mAb против β-актина были приобретены в Santa Cruz Biotechnology (sc81178). HRP-конъюгированные козьи анти-кроличьи IgG (H + L) и HRP-конъюгированные козьи антимышиные IgG (H + L) были приобретены у ThermoFisher Scientific (ZB-2301 и ZB-2305).Конъюгированный с HRP мышиный IgG кролика (легкая цепь) был приобретен у Sangon Biotech (D110059-0100). IgG мыши и IgG кролика были приобретены у BOSTER (BA1046 и BA1045). Меченый Alexa Fluor 488 козьих антител против мышиных IgG (H + L), меченных Alexa Fluor 647 козьих антител против кроличьих IgG (H + L) и окрашивающий раствор DAPI были приобретены у Beyotime (A0428, A0468 и C1006).

  Выделение РНК и количественная ПЦР

  Трансфицированные клетки собирали и общую РНК экстрагировали с использованием TRIzol (Invitrogen, 15596-026) в соответствии с инструкциями производителя.кДНК синтезировали с помощью обратной транскриптазы M-MLV (Promega, M1705). Недавно синтезированная кДНК была использована в качестве матрицы для амплификации IFN- β , ISG15, ISG56, CXCL10 и GAPDH . Пары праймеров для IFN- β, ISG15, ISG56, CXCL0 и GAPDH были описаны ранее (22, 24). Относительная количественная ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР) была проведена на приборе BioRad StepOne с использованием TransStart ^® Tip Green qPCR SuperMix (Transgen, AQ141-02), а GAPDH использовался в качестве внутреннего контроля с условиями 95 ° C для 3 мин, затем 40 циклов при 95 ° C в течение 10 с и 55 ° C в течение 30 с.Разность экспрессии рассчитывалась на основе 2 ^{— ΔΔCt} значений.

  Нокдаун ICP27 с помощью siRNA

  последовательностей миРНК HSV-2 были описаны ранее (25) и перечислены в дополнительной таблице 1. Все миРНК были синтезированы Eurofins Genomics. Клетки HeLa или ME180 высевали в 6-луночные планшеты в течение ночи. Отрицательный контроль или миРНК трансфицировали в клетки HeLa или ME180 с использованием липофектамина 2000 (Life Technology, 11668019) в соответствии с инструкциями производителя.Через 4 часа после трансфекции клетки HeLa инфицировали HSV-2 или без него при MOI 1 или клетки ME180 при MOI 0,5. Через 20 часов после инфицирования клетки стимулировали 100 HAU мл ^-1 SeV или без них в течение 16 часов, и супернатанты собирали для ELISA или клетки лизировали для анализа DLR.

  Поли (I: C) Стимуляция

  Клетки

  HeLa или ME180 высевали в 6-луночные планшеты в течение ночи и трансфицировали пустым вектором, плазмидой экспрессии HSV-2 ICP27, плазмидой экспрессии HSV-2 ICP22 или плазмидой экспрессии вируса гриппа NS1.Через 24 ч после трансфекции клетки трансфицировали 2 мкг / лунку Poly (I: C) (Sigma; P1530-25MG) с использованием липофектамина 2000 (Life Technology, 11668019) или ложно-трансфецировали. Через 16 часов после трансфекции клетки лизировали для анализа DLR или супернатанты собирали для ELISA.

  ELISA для IFN-β

  Клетки

  HEK 293T высевали в 6-луночные планшеты в течение ночи и трансфицировали пустым вектором, плазмидой экспрессии HSV-2 ICP27 или плазмидой экспрессии вируса гриппа NS1. Через 24 часа после трансфекции клетки стимулировали 100 HAU мл ^-1 SeV или без них в течение 16 часов.Супернатанты клеточных культур собирали и центрифугировали для удаления клеточного дебриса. Пятьдесят микролитров супернатантов использовали для определения IFN-β с использованием набора VeriKine ™ Human IFN Beta ELISA (PBL Assay Science, 41410) в соответствии с инструкциями производителя.

  Иммунофлуоресцентный анализ

  клеток HeLa высевали в чашки со стеклянным дном диаметром 35 мм и трансфицировали пустым вектором, плазмидой экспрессии HSV-2 ICP27-HA или плазмидой экспрессии вируса гриппа NS1. Через 24 часа после трансфекции клетки HeLa стимулировали с использованием или без 100 HAU мл ^-1 SeV в течение 16 часов.Клетки фиксировали 4% параформальдегидом и повышали проницаемость 0,2% Triton X-100. После трех промывок PBS клетки блокировали PBS, содержащим 5% BSA, в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем инкубировали с кроличьими поликлональными антителами против IRF3 человека и мышиными mAb против HA-tag в разведении 1: 100 в течение 1 часа. при комнатной температуре. После трех промывок PBS клетки инкубировали с меченными Alexa Fluor 488 козьими антителами против мышиного IgG (H + L) и меченными Alexa Fluor 647 козьими анти-кроличьими IgG (H + L) в разведении 1:50 для 1 ч при комнатной температуре.Затем клетки промывали и инкубировали с раствором DAPI в течение 10 мин при комнатной температуре. После добавления в чашки 1 мл PBS клетки наблюдали под многофотонным конфокальным микроскопом (Nikon, A1 MP STORM).

  Анализ коиммунопреципитации

  Клетки

  HEK 293T высевали в 6-луночные планшеты и трансфицировали плазмидой ICP27-Flag или пустым вектором. Через 24 часа после трансфекции клетки стимулировали 100 HAU мл ^-1 SeV или без них в течение 16 часов. Белки, экстрагированные из трансфицированных клеток, получали с использованием буфера для лизиса Pierce ™ IP (ThermoFisher Scientific, 87787).Три микрограмма мышиного антитела против Flag или контрольного мышиного IgG разводили в 200 мкл PBS с 0,2% Tween-20 (PBST) и добавляли к свежему белку G Dynabeads (Invitrogen, 10009D). После инкубации с вращением при 4 ° C в течение ночи комплексы Dynabeads-Ab один раз промывали 200 мкл PBST перед смешиванием с образцами с последующей инкубацией при 4 ° C в течение ночи. Комплексы трижды промывали PBST, а целевые Ag подвергали Вестерн-блоттингу после элюирования кипячением.

  Кинетический анализ связывания

  клеток HEK 293F использовали для экспрессии и очистки ICP27-Flag и IRF3-Flag.На каждые 1 × 10 ⁶ клеток 1,5 мкг экспрессионной плазмиды трансфицировали в клетки HEK 293F с использованием реагента для трансфекции полиэтиленимином (PEI) (Polysciences, 23966-1). Клетки культивировали в среде для экспрессии FreeStyle 293 (Gibico, 12338018) при 37 ° C в шейкере-инкубаторе с 5% CO ₂ при 135 об / мин. На 3 день после трансфекции клетки собирали и лизировали ультразвуковой обработкой. Белок с меткой Flag очищали аффинной смолой Anti-DYKDDDDK G1 (GeneScript, L00432) и элюировали 3 М NaCl.Очищенный белок концентрировали в PBS с использованием 30 кДа центробежных фильтров (Merck, UFC8) для исследования кинетики связывания.

  Кинетику связывания проводили на системе Forte-Bio Octet Red, как описано ранее (26). Эта система отслеживает интерференцию света, отраженного от поверхности датчика, для измерения толщины молекул, связанных с поверхностью датчика. IRF3-Flag конъюгировали с биотином при соотношении молекулярных масс 1: 3 при комнатной температуре в течение 1 ч с последующими промываниями, а затем концентрировали в PBS для удаления диссоциативного биотина.10 микрограмм / миллилитр биотинилированного IRF3-Flag соединяли с Biosenors (Fortebio, 18-5019) и погружали в различные концентрации ICP27-Flag (50, 200, 500 или 800 нМ) для ассоциации и диссоциации. Отклик сдвига в нм регистрировали как функцию времени.

  Статистический анализ

  Все эксперименты были повторены не менее трех раз, и данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, если не указано иное. Анализ данных выполняли с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 7 (GraphPad).Сравнение между двумя группами было проанализировано с использованием двустороннего непарного теста Стьюдента t . P <0,05 считалось статистически значимым.

  Результаты

  ВПГ-2 ICP27 ингибирует продукцию IFN-β в эпителиальных клетках слизистой оболочки человека

  HSV-2 ускользает от врожденного иммунитета слизистых оболочек, но лежащие в основе механизмы остаются неуловимыми (16). Наше предыдущее исследование показало, что немедленный ранний белок HSV-2 ICP22 сильно ингибирует продукцию IFN-β; однако нокаут ICP22 не полностью устраняет ингибирующую активность в отношении продукции IFN-β в контексте инфекции HSV-2 (22), в то время как другие белки IE, включая ICP27 (UL54), также, по-видимому, участвуют, но основной механизм остается открытым. быть полностью исследованным.В этом исследовании мы провели эксперименты, чтобы оценить, действительно ли HSV-2 ICP27 ингибирует индукцию IFN-β, и если да, то каков основной механизм. Сначала мы подтвердили, что IFN-β экспрессируется на очень низком уровне в тканях шейки матки человека, инфицированных HSV-2 (рис. 1A), сообщая, что HSV-2 ингибирует индукцию IFN-β во время инфекции слизистой оболочки. Чтобы оценить вклад HSV-2 ICP27 в препятствование индукции IFN-β, клетки HEK 293T высевали в 24-луночные планшеты в течение ночи и котрансфицировали пустым вектором pcDNA3.1 (+), плазмида, экспрессирующая HSV-2 ICP27 или положительный контроль NS1 вируса гриппа вместе с репортерной плазмидой p125-Luc и внутренним контролем phRL-TK. Через 24 часа после трансфекции клетки стимулировали 100 HAU мл ^-1 SeV или без них в течение 16 часов. Как показано на рисунке 1B, HSV-2 ICP27 сильно ингибировал активацию промотора IFN-β. Впоследствии мы исследовали, ингибирует ли HSV-2 ICP27 продукцию IFN-β на уровне мРНК или белка. Клетки HEK 293T высевали в 6-луночные планшеты в течение ночи и трансфицировали pcDNA3.1 (+), плазмида, экспрессирующая HSV-2 ICP27 или NS1 вируса гриппа. Через 24 часа после трансфекции клетки стимулировали 100 HAU мл ^-1 SeV или без них в течение 16 часов. Полные РНК экстрагировали, и мРНК IFN-β анализировали с помощью RT-PCR. Как показано на рисунке 1C, HSV-2 ICP27 значительно ингибировал продукцию мРНК IFN-β. Уровень белков IFN-β в супернатантах измеряли с помощью ELISA, показав, что HSV-2 ICP27 значительно ингибировал продукцию INF-β на уровне белка (рис. 1D).

  Рисунок 1 .HSV-2 ICP27 ингибирует продукцию IFN-β эпителиальными клетками слизистой оболочки человека. (A) HSV-2 ингибирует продукцию IFN-β в тканях шейки матки человека. Ткани шейки матки человека были подготовлены и инфицированы HSV-2 или без него. При 4 h.p.i ткани стимулировали с использованием или без 100 HAU мл ^-1 SeV в течение 16 часов, и супернатанты собирали для ELISA. (B) HSV-2 ICP27 ингибирует активацию промотора IFN-β. Клетки HEK 293T высевали в 24-луночные планшеты и котрансфицировали пустым вектором pcDNA3.1 (+), HSV-2 ICP27 или плазмида, экспрессирующая NS1 вируса гриппа, вместе с репортерной плазмидой p125-Luc и внутренним контролем phRL-TK. Через 24 часа после трансфекции клетки стимулировали или без 100 HAU мл ^-1 SeV в течение 16 часов и лизировали для анализа DLR. (C, D) HSV-2 ICP27 ингибирует продукцию IFN-β как на уровне мРНК, так и на уровне белка. Клетки HEK 293T высевали в 6-луночные планшеты и трансфицировали пустым вектором pcDNA3.1 (+), плазмидой, экспрессирующей HSV-2 ICP27 или NS1 вируса гриппа.Через 24 часа после трансфекции клетки стимулировали 100 HAU мл ^-1 SeV в течение 16 часов и общую РНК экстрагировали для RT-PCR (C) , в то время как супернатанты собирали для ELISA (D). . (E) HSV-2 ингибирует вызванную Poly (I: C) активацию промотора IFN-β. Клетки HeLa высевали в 6-луночные планшеты и котрансфицировали пустым вектором pcDNA3.1 (+), плазмидой, экспрессирующей HSV-2 ICP27, ICP22 или NS1 вируса гриппа, вместе с репортерной плазмидой p125-Luc и внутренним контролем phRL. -ТК.Через 24 часа после трансфекции клетки трансфицировали 2 мкг / лунку Poly (I: C) или ложно-трансфицировали в течение 16 часов и лизировали для анализа DLR. (F) HSV-2 ICP27 ингибирует Poly (I: C) -индуцированную продукцию IFN-β на уровне белка. Клетки HeLa высевали в 6-луночные планшеты и трансфицировали пустым вектором pcDNA3.1 (+), плазмидой, экспрессирующей HSV-2 ICP27 или ICP22. Через 24 часа после трансфекции клетки трансфицировали 2 мкг / лунку Poly (I: C) или ложно-трансфицировали в течение 16 часов, и супернатанты собирали для ELISA. (G – I) HSV-2 ICP27 подавляет продукцию ISG. Клетки HEK 293T высевали в 6-луночные планшеты и трансфицировали пустым вектором pcDNA3.1 (+) или плазмидой, экспрессирующей HSV-2 ICP27. Через 24 часа после трансфекции клетки стимулировали 100 HAU мл ^-1 SeV в течение 16 часов и лизировали для RT-PCR для измерения экспрессии ISG56 (D) , ISG15 (E ) и CXCL10 (F) на уровне мРНК. Представленные данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов, при этом каждое условие выполнялось в трех повторностях (среднее ± стандартное отклонение) (A – I) .* P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001; **** П <0,0001.

  В дополнение к стимуляции SeV, мы также проводили эксперименты в условиях экспрессии IFN-β, индуцированной полиинозиновой-полицитидиловой кислотой [Poly (I: C)], искусственной последовательностью дцРНК, которая может стимулировать путь передачи сигнала RIG-I (27) . Клетки HeLa котрансфицировали pcDNA3.1 (+), плазмидой, экспрессирующей HSV-2 ICP27, HSV-2 ICP22 или NS1 вируса гриппа, вместе с репортерной плазмидой p125-Luc и внутренним контролем phRL-TK.Через 24 часа после трансфекции клетки стимулировали Poly (I: C) в течение 16 часов и лизировали для анализа DLR. Результаты показали, что HSV-2 ICP27 сильно ингибирует Poly (I: C) -индуцированную активацию промотора IFN-β (рис. 1E). Кроме того, клетки HeLa трансфицировали pcDNA3.1 (+), плазмидой, экспрессирующей HSV-2 ICP27, HSV-2 ICP22 или NS1 вируса гриппа. Через 24 часа после трансфекции клетки стимулировали Poly (I: C) в течение 16 часов, и супернатанты собирали для ELISA. Результаты показали, что HSV-2 ICP27 сильно ингибирует индуцированную Poly (I: C) индукцию IFN-β на уровне белка (фиг. 1F).Кроме того, HSV-2 ICP27 также значительно ингибировал вызванную Poly (I: C) активацию промотора IFN-β в клетках ME180 (дополнительная фигура 1A).

  Нарушение экспрессии IFN типа I приводит к снижению экспрессии нижестоящих генов, стимулированных интерферонами (ISG) (28, 29). Чтобы изучить влияние HSV-2 ICP27 на экспрессию ISG, клетки HEK 293T трансфицировали пустым вектором pcDNA3.1 (+) или плазмидой, экспрессирующей HSV-2 ICP27, с последующей стимуляцией SeV в течение 16 часов. Полные РНК были извлечены, и мРНК ISG, включая ISG56, ISG15 и CXCL10 , были проанализированы с помощью RT-PCR.Как показано на фиг. 1G-I, HSV-2 ICP27 сильно ингибировал экспрессию ISG56, ISG15 и CXCL10 на уровне мРНК.

  Продемонстрировав критическую роль ICP27 HSV-2 в ингибировании индукции IFN-β, мы затем провели эксперименты, чтобы изучить влияние HSV-2 ICP27 на индукцию IFN-β в контексте инфекции HSV-2. Клетки HeLa котрансфицировали репортерной плазмидой p125-Luc и phRL-TK внутреннего контроля вместе с миРНК отрицательного контроля, миРНК-1 ICP27 или миРНК-2 ICP27 с последующим инфицированием HSV-2.Затем клетки стимулировали или без 100 HAU мл ^-1 SeV в течение 16 часов и лизировали для анализа DLR. Как показано на фиг. 2A, нокдаун HSV-2 ICP27 с помощью ICP27 siRNA-1 снижает способность HSV-2 ингибировать продукцию IFN-β на уровне активации промотора. Чтобы оценить влияние ВПГ-2 ICP27 на продукцию IFN-β на уровне белка, клетки HeLa обрабатывали миРНК отрицательного контроля, миРНК-1 ICP27 или миРНК-2 ICP27 с последующим заражением HSV-2. Через 24 часа после инфицирования супернатанты собирали для ELISA и клетки лизировали для вестерн-блоттинга.Как показано на рисунке 2B, нокдаун HSV-2 ICP27 с помощью ICP27 siRNA-1 снижает способность HSV-2 ингибировать продукцию IFN-β на уровне белка. Нокдаун HSV-2 ICP27 был обнаружен моноклональным антителом против HSV-2 ICP27, в то время как β-актин использовался в качестве внутреннего контроля (рис. 2C). Мы также обнаружили, что нокдаун HSV-2 ICP27 снижает способность HSV-2 ингибировать активацию промотора IFN-β в клетках ME180 (дополнительный рисунок 1B).

  Рисунок 2 . HSV-2 ICP27 подавляет продукцию IFN-β в контексте вирусной инфекции. (A) Нокдаун ICP27 снижает способность HSV-2 ингибировать активацию промотора IFN-β. Клетки HeLa высевали в 6-луночные планшеты и котрансфицировали siRNA-1 HSV-2 ICP27, siRNA-2 или миРНК отрицательного контроля (N) вместе с репортерной плазмидой p125-Luc и phRL-TK внутреннего контроля. Через 4 часа после трансфекции клетки инфицировали HSV-2 при MOI 1 или ложно инфицировали. При 20 h.p.i клетки стимулировали с использованием или без 100 HAU мл ^-1 SeV в течение 16 часов и лизировали для анализа DLR. (B) Нокдаун ICP27 снижает способность HSV-2 ингибировать продукцию IFN-β на уровне белка. Клетки HeLa высевали в 6-луночные планшеты и трансфицировали миРНК-1 HSV-2 ICP27, миРНК-2 или миРНК отрицательного контроля (N). Через 4 часа после трансфекции клетки инфицировали HSV-2 при MOI 1 или ложно инфицировали. При 20 h.p.i клетки стимулировали с использованием или без 100 HAU мл ^-1 SeV в течение 16 часов, и супернатанты собирали для ELISA. (C) Эффективность нокдауна siRNA HSV-2 ICP27.Клетки HeLa высевали в 6-луночные планшеты и трансфицировали миРНК-1 HSV-2 ICP27, миРНК-2 или миРНК отрицательного контроля (N). Через 4 часа после трансфекции клетки инфицировали HSV-2 при MOI 1 или ложно инфицировали. При 20 h.p.i клетки стимулировали с использованием или без 100 HAU мл ^-1 SeV в течение 16 часов и лизировали для вестерн-блоттинга. Сканирование шкалы серого выполнялось программой Image J (версия 1.52a). Приведенные данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов, при этом каждое условие выполнялось в трех повторностях (среднее ± стандартное отклонение) (A, B) .* P <0,05; *** P <0,001. Один репрезентативный эксперимент из трех показан (C) .

  HSV-2 в основном поражает эпителиальные клетки и вызывает генитальный герпес. В дополнение к клеточным линиям цервикальной ткани и цервиковагинального эпителия человека мы провели эксперименты с использованием первичных эпителиальных клеток крайней плоти человека. Эпителиальные клетки крайней плоти человека были изолированы и трансфицированы пустым вектором pcDNA3.1 (+), плазмидой, экспрессирующей HSV-2 ICP27 или ICP22, или инфицированы HSV-2, с последующей стимуляцией 100 HAU мл или без них ^-1 SeV в течение 16 часТотальные РНК экстрагировали для ОТ-ПЦР, а супернатанты собирали для ELISA. В первичных эпителиальных клетках крайней плоти человека HSV-2 ICP27 значительно ингибировал SeV-индуцированную продукцию IFN-β как на уровне мРНК (рис. 3A), так и на уровне белка (рис. 3B). Эти результаты показали, что HSV-2 ICP27 может ингибировать индукцию IFN-β в первичных эпителиальных клетках слизистой оболочки.

  Рисунок 3 . HSV-2 ICP27 ингибирует продукцию IFN-β в первичных эпителиальных клетках слизистой оболочки. (A, B) HSV-2 ICP27 ингибирует продукцию IFN-β в эпителиальных клетках крайней плоти человека.Первичные эпителиальные клетки выделяли из тканей крайней плоти человека и трансфицировали пустым вектором pcDNA3.1 (+), плазмидой, экспрессирующей HSV-2 ICP27 или ICP22, или инфицировали HSV-2. Через 24 часа после трансфекции клетки стимулировали 100 HAU мл ^-1 SeV или без них в течение 16 часов, и общую РНК экстрагировали для RT-PCR (A) , а супернатанты собирали для ELISA (B ) . Приведенные данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов, при этом каждое условие выполнялось в трех повторностях (среднее ± стандартное отклонение) (A, B) .* P <0,05; ** P <0,01.

  В целом, вышеупомянутые данные свидетельствуют о том, что HSV-2 ICP27 играет важную роль в препятствовании индукции IFN-β в тканях шейки матки человека, линиях цервиковагинальных эпителиальных клеток и первичных эпителиальных клетках слизистой оболочки человека.

  ВПГ-2 ICP27 ингибирует продукцию IFN-β посредством сигнального пути IRF3

  Сообщалось, что

  HSV-1 ICP27 ингибирует IFN типа I, взаимодействуя с комплексом STING-TBK1 в макрофагах (30), тогда как наше предыдущее исследование показало, что HSV-2 может прерывать опосредованный RIG-I сигнальный путь IFN-β в эпителиальном слое человека. ячейки (22).Учитывая, что ДНК-вирусы продуцируют дцРНК во время репликации вируса, которые могут распознаваться сенсорами РНК, такими как RIG-I (31, 32), наше текущее исследование сосредоточено на том, как HSV-2 ICP27 препятствует опосредованной дцРНК индукции IFN типа I. Сначала мы определили, влияет ли HSV-2 ICP27 на путь передачи сигналов, опосредованный IRF3. Клетки HEK 293T высевали в 24-луночные планшеты в течение ночи и котрансфицировали пустым вектором pcDNA3.1 (+), плазмидой, экспрессирующей HSV-2 ICP27 или вирусом гриппа NS1, вместе с PRD (III-I) ₄ -Luc который содержит четыре повтора IRF3-чувствительного домена промотора IFN-β и phRL-TK внутреннего контроля.Через 24 часа после трансфекции клетки стимулировали или без 100 HAU мл ^-1 SeV в течение 16 часов и лизировали для анализа DLR. Как показано на фиг. 4A, HSV-2 ICP27 блокирует активацию промотора, чувствительного к IRF3, индуцированную SeV.

  Рисунок 4 . HSV-2 ICP27 ингибирует продукцию IFN-β через сигнальный путь IRF3. (A) HSV-2 ICP27 ингибирует промоторный элемент IRF3 PRD (III-I) _4. Клетки HEK 293T высевали в 24-луночные планшеты и котрансфицировали пустым вектором pcDNA3.1 (+), плазмида, экспрессирующая HSV-2 ICP27 или NS1 вируса гриппа, вместе с PRD (III-I) ₄ -Luc и внутренним контролем phRL-TK. Через 24 часа после трансфекции клетки стимулировали или без 100 HAU мл ^-1 SeV в течение 16 часов и лизировали для анализа DLR. (B – F) HSV-2 ICP27 ингибирует индуцированную RIG-I, MAVS, TBK1, IKK-ε или IRF3-5D активацию промотора IFN-β дозозависимым образом. Клетки HEK 293T высевали в 24-луночные планшеты и котрансфицировали пустым вектором pcDNA3.1 (+) или плазмидой, экспрессирующей HSV-2 ICP27, и плазмидой, экспрессирующей компонент пути передачи сигнала IRF3 RIG-IN, MAVS, TBK1, IKK-ε, или IRF3-5D вместе с репортерной плазмидой p125-Luc и внутренним контролем phRL-TK.Через 40 часов после трансфекции клетки лизировали для анализа DLR. В то же время клетки лизировали для вестерн-блоттинга. RIG-I, MAVS, TBK1, IKK-ε и IRF3-5D детектировались Anti-FLAG Ab, тогда как актин детектировался Anti-actin Ab. Представленные данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов, при этом каждое условие выполнялось в трех повторностях (среднее ± стандартное отклонение) (A – F) . * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001; **** П <0,0001. Для вестерн-блоттинга показан один репрезентативный эксперимент из трех: (B – F) .

  Затем мы провели эксперименты, чтобы выяснить, влияет ли HSV-2 ICP27 напрямую на путь передачи сигналов IRF3. Клетки HEK 293T высевали в 24-луночные планшеты в течение ночи и котрансфицировали плазмидой, экспрессирующей компонент сигнального пути IRF3, RIG-IN, MAVS, TBK1, IKK-ε или IRF3-5D, и плазмиду, экспрессирующую HSV-2 ICP27, или пустой вектор pcDNA3. .1 (+) вместе с репортерной плазмидой p125-Luc и внутренним контролем phRL-TK. Как показано на фиг. 4B-F, HSV-2 ICP27 блокирует активацию промотора IFN-β, индуцированную всеми тестируемыми компонентами сигнального пути IRF3, дозозависимым образом.

  В целом, приведенные выше результаты показывают, что, в отличие от HSV-1 ICP27, HSV-2 ICP27 ингибирует индукцию IFN-β через IRF3-зависимый путь.

  HSV-2 ICP27 Блокирует активацию IRF3 путем физического взаимодействия с IRF3

  Есть два основных этапа, участвующих в активации IRF3, фосфорилировании и ядерной транслокации (12). Сначала мы исследовали, препятствует ли HSV-2 ICP27 ядерной транслокации IRF3. Клетки Hela высевали в чашки со стеклянным дном диаметром 35 мм в течение ночи и трансфицировали плазмидой, экспрессирующей HSV-2 ICP27-HA, или NS1 вируса гриппа, или пустым вектором pcDNA3.1 (+). Через 24 часа после трансфекции клетки стимулировали 100 HAU мл ^-1 SeV или без них в течение 16 часов. Непрямой иммунофлуоресцентный анализ выполняли для оценки локализации IRF3 в присутствии или в отсутствие HSV-2 ICP27. Как показано на фиг. 5A, транслокация IRF3 из цитоплазмы в ядро ​​была частично заблокирована в присутствии HSV-2 ICP27.

  Рисунок 5 . HSV-2 ICP27 блокирует активацию IRF3 путем физического взаимодействия. (A) HSV-2 ICP27 препятствует ядерной транслокации IRF3.Клетки HeLa высевали в чашки со стеклянным дном диаметром 35 мм и трансфицировали пустым вектором pcDNA3.1 (+), плазмидой, экспрессирующей HSV-2 ICP27-HA или вирусом гриппа NS1-HA. Через 24 часа после трансфекции клетки стимулировали 100 HAU мл ^-1 SeV или без них в течение 16 часов и готовили для иммунофлуоресцентного анализа. IRF3 был обнаружен при длине волны 647 нм, ICP27-HA или NS1-HA — при длине волны 488 нм, а ядра — при длине волны 405 нм. (B) HSV-2 ICP27 ингибирует фосфорилирование IRF3. Клетки HEK 293T высевали в 6-луночные планшеты и трансфицировали pcDNA3.1 (+), плазмида, экспрессирующая HSV-2 ICP27 или NS1 вируса гриппа. Через 24 часа после трансфекции клетки стимулировали 100 HAU мл ^-1 SeV или без них в течение 16 часов. Были выделены ядерные и цитоплазматические белки, и фосфорилированный IRF3 был обнаружен с помощью mAb p-IRF3. (C) HSV-2 ICP27 взаимодействует с эндогенным IRF3. Клетки HEK 293T высевали в 6-луночные планшеты и трансфицировали pcDNA3.1 (+) или HSV-2 ICP27-Flag. Через 24 часа после трансфекции клетки стимулировали 100 HAU мл ^-1 SeV или без них в течение 16 часов и лизировали для анализа иммунопреципитации.Один репрезентативный эксперимент из трех показан (A – C) . (D) Кинетика связывания ICP27-IRF3. Кинетику связывания проводили на системе Forte-Bio Octet Red. Очищенный IRF3 конъюгировали с биотином при соотношении молекулярных масс 1: 3. Десять микрограмм / миллилитр биотинилированного IRF3-Flag соединяли с биосенорами и погружали в различные концентрации ICP27-Flag (50, 200, 500 или 800 нМ) для ассоциации и диссоциации. Отклик сдвига в нм регистрировали как функцию времени.КД (М) = 2,03Е-08.

  Последующие эксперименты были проведены, чтобы проверить, блокирует ли HSV-2 ICP27 фосфорилирование IRF3. Клетки HEK 293T высевали в 6-луночные планшеты в течение ночи и трансфицировали плазмидой, экспрессирующей HSV-2 ICP27 или NS1 вируса гриппа, или пустым вектором. Через 24 часа после трансфекции клетки стимулировали 100 HAU мл ^-1 SeV или без них в течение 16 часов. Фосфорилирование IRF3 было обнаружено антителом против p-IRF3, показав, что HSV-2 ICP27 значительно ингибировал фосфорилирование IRF3 в клетках (дополнительная фигура 2) и особенно в ядре (фигура 5B).

  Затем мы спросили, существует ли взаимодействие между HSV-2 ICP27 и IRF3. Поэтому была проведена коиммунопреципитация (Co-IP). Клетки HEK 293T высевали в 6-луночные планшеты в течение ночи и трансфицировали плазмидой, экспрессирующей HSV-2 ICP27-Flag, или пустым вектором pcDNA3.1 (+). Через 24 часа после трансфекции клетки стимулировали 100 HAU мл ^-1 SeV или без них в течение 16 часов с последующим Co-IP с контрольным IgG или антителом против Flag. Осадки анализировали вестерн-блоттингом с использованием антител против IRF3 против эндогенного IRF3.Как показано на фиг. 5C, HSV-2 ICP27 был способен специфически осаждать эндогенный IRF3, что указывает на физическое взаимодействие между HSV-2 ICP27 и IRF3. Чтобы дополнительно подтвердить взаимодействие между IRF3 и ICP27, мы очистили белки ICP27 и IRF3 и провели кинетические анализы связывания. Биотинилированный IRF3-Flag был присоединен к биосенорам и погружен в различные концентрации ICP27-Flag для ассоциации и диссоциации. Как показано на рисунке 5D, существует сильная связь между IRF3 и ICP27, а более высокая концентрация ICP27 приводит к более сильной связи.

  В совокупности эти результаты показывают, что HSV-2 ICP27 противодействует сигнальному пути IRF3, взаимодействуя с IRF3.

  Домен 1-138aa HSV-2 ICP27 в основном отвечает за ингибирование индукции IFN-β

  Для картирования функциональной области HSV-2 ICP27, участвующей в ингибировании продукции IFN-β, мы сконструировали несколько усеченных мутантов HSV-2 ICP27 в соответствии с его структурой (https://www.uniprot.org/uniprot/P28276) ( Рисунок 6А). Клетки HEK 293T котрансфицировали пустым вектором pcDNA3.1 (+), усеченная или полноразмерная плазмида, экспрессирующая HSV-2 ICP27, с репортерной плазмидой p125-Luc и внутренним контролем phRL-TK. Через 24 часа после трансфекции клетки стимулировали или без 100 HAU мл ^-1 SeV в течение 16 часов и лизировали для анализа DLR. Для измерения IFN-β на уровне белка клетки HEK 293T трансфицировали пустым вектором pcDNA3.1 (+), усеченной или полноразмерной плазмидой, экспрессирующей HSV-2 ICP27, с последующей стимуляцией 100 HAU мл или без нее ^-1 SeV в течение 16 ч, и супернатанты собирали для ELISA.Как показано на фиг. 6B, C, домен 1-138aa HSV-2 ICP27 значительно ингибировал индукцию IFN-β как на уровне активации промотора, так и на уровне белка, и его способность была сравнима с таковой у полноразмерного HSV-2 ICP27. Экспрессию мутантов ICP27 подтверждали вестерн-блоттингом (дополнительная фигура 3). В отличие от HSV-1 ICP27 (30), мы не наблюдали прямого вклада RGG-бокса, который расположен в 138-152aa домене HSV-2 ICP27, в ингибированную индукцию IFN-β. Наши результаты показывают, что домен 1-138aa, а не RGG-бокс HSV-2 ICP27, в основном отвечает за ингибирование индукции IFN-β.

  Рисунок 6 . Картирование ключевого домена HSV-2 ICP27, который ингибирует продукцию IFN-β. (A) Иллюстрация структурного домена HSV-2 ICP27. 110-138aa — сигнал ядерной локализации ICP27; 138-152aa — домен RGG-бокса; 303-509aa представляет собой семейство регуляторов транскрипции герпесвирусов UL69; 400-488aa — домен цинкового безымянного пальца. (B) Домен 1-138aa ICP27 ингибирует активацию промотора IFN-β. Клетки HEK 293T высевали в 24-луночные планшеты и котрансфицировали пустым вектором pcDNA3.1 (+), плазмида, экспрессирующая HSV-2 ICP27 или его усеченный мутант, вместе с репортерной плазмидой p125-Luc и внутренним контролем phRL-TK. Через 24 часа после трансфекции клетки стимулировали или без 100 HAU мл ^-1 SeV в течение 16 часов и лизировали для анализа DLR. (C) Домен 1-138aa ICP27 ингибирует индукцию IFN-β на уровне белка. Клетки HEK 293T высевали в 24-луночные планшеты и трансфицировали пустым вектором pcDNA3.1 (+), плазмидой, экспрессирующей HSV-2 ICP27 или его усеченным мутантом.Через 24 часа после трансфекции клетки стимулировали 100 HAU мл ^-1 SeV или без них в течение 16 часов, и супернатанты собирали для ELISA. Приведенные данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов, при этом каждое условие выполнялось в трех повторностях (среднее ± стандартное отклонение) (A, B) . * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001.

  Обсуждение

  HSV-2 представляет собой крупный оболочечный вирус дцДНК, и его инфекции, как известно, ограничиваются слизистой оболочкой, ороговевшим эпителием и нервными ганглиями.Инфекция HSV-2 вызывает генитальный герпес, основным путем передачи которого является половой путь. Известно, что HSV-2 может уклоняться от врожденного иммунитета слизистой оболочки хозяина, но основные механизмы еще предстоит определить (16). Наше текущее исследование продемонстрировало, что немедленный ранний белок HSV-2, ICP27, препятствует опосредованной RIG-I-MAVS-IRF3 индукции IFN-β в эпителиальных клетках слизистой оболочки и клетках HEK 293T. Механически ICP27 напрямую связывается с IRF3 и ингибирует его фосфорилирование и ядерную транслокацию, что приводит к ингибированию индукции IFN-β.Результаты этого исследования показывают нетрадиционную стратегию, используемую вирусом дцДНК для прерывания пути передачи сигналов IFN типа I.

  Принято считать, что ДНК-вирусы распознаются датчиками ДНК, такими как TLR9 и cGAS (33), в то время как вирусы РНК распознаются датчиками РНК, включая TLR3, TLR7 / 8, RIG-I и MDA5 (34, 35). Действительно, в ряде исследований HSV-1 сообщается, что вирус может вмешиваться в путь cGAS-STING, подавляя индукцию IFN типа I (30, 36–38). Интересно, что ранее мы обнаружили, что HSV-2 может также прерывать путь RIG-I-MAVS-IFN-β в эпителиальных клетках слизистой оболочки человека (22).Одно из объяснений состоит в том, что ДНК-вирусы продуцируют дцРНК во время своих циклов репликации, которые могут распознаваться сенсорами РНК, такими как RIG-I (31, 32). Кроме того, сообщалось, что STING участвует в распознавании РНК-вирусов (39). В случае HSV-2 его РНК быстро генерируются в течение жизненного цикла его первичной инфекции (40), что может представлять собой важный альтернативный источник патоген-ассоциированных молекулярных паттернов для запуска врожденных иммунных ответов.

  ВПГ-2 и ВПГ-1 имеют разные начальные места инфицирования и передачи, причем ВПГ-2 в основном приводит к генитальным инфекциям, а ВПГ-1 обычно вызывает орофациальные инфекции (41).Кроме того, ВПГ-2 имеет высокую частоту инфекций и общие пути передачи ВИЧ-1 через слизистые оболочки (42). Например, HSV-2 преимущественно инфицирует эпителиальные клетки слизистой оболочки, которые формируют первичные барьеры слизистой оболочки против инфекции ВИЧ-1, и прерывание этих барьеров может способствовать передаче ВИЧ-1 (5). В текущем исследовании мы обнаружили, что HSV-2 может значительно ингибировать индукцию IFN-β в тканях шейки матки человека. Более того, используя в качестве моделей линии эпителиальных клеток слизистой оболочки и клетки первичного эпителия слизистой оболочки, мы продемонстрировали, что HSV-2 ICP27 способствует такой ингибированной индукции IFN-β.Значение ICP27 HSV-2 в ингибировании индукции IFN-β было дополнительно подтверждено в контексте вирусной инфекции путем специфического нокдауна siRNA HSV-2 ICP27, хотя нокдаун HSV-2 ICP27 не полностью устранял опосредованное HSV-2 ингибирование. индукции IFN-β. Учитывая сложность генома HSV-2, кодирующего по меньшей мере 74 белка, весьма вероятно, что другие неидентифицированные белки HSV-2 также могут вносить вклад в подавление продукции IFN-β. Из-за важности IFN-β в ингибировании передачи через слизистую оболочку SHIV (43) необходимы будущие исследования для изучения того, играет ли опосредованное инфекцией HSV-2 снижение IFN-β в усилении генитальной передачи ВИЧ-1.

  В текущем исследовании мы показали, что HSV-2 ICP27 может ингибировать продукцию IFN-β посредством пути RIG-I-MAVS. HSV-1/2 ICP27 является важным многофункциональным ранним белком, который регулирует экспрессию вирусных генов (44, 45). На сегодняшний день большинство исследований ICP27 сосредоточено на HSV-1 (44–46). Например, было показано, что HSV-1 ICP27 ингибирует фосфорилирование и накопление STAT-1 в ядре, что приводит к прерыванию передачи сигналов IFN типа I (47). В соответствии с этим, нокаут HSV-1 ICP27 усиливал активацию IRF3 и NF-κB в макрофагах и DC (48).Совсем недавно сообщалось, что HSV-1 ICP27 ингибирует индукцию IFN типа I, вмешиваясь в сигнальный путь cGAS – STING – TBK1 в макрофагах человека (30). Однако оказалось, что ICP27 HSV-1 не мешает фосфорилированию TBK1, и ассоциация HSV-1 ICP27 с TBK1 требует STING (30). В соответствии с этим мы обнаружили, что HSV-2 ICP27 сильно ингибирует продукцию IFN-β в клеточной линии HEK 293T (22), которая не экспрессирует STING (49), что еще больше подтверждает, что HSV-2 ICP27 может ингибировать продукцию IFN через Независимый путь cGAS – STING – TBK1.

  IRF3 играет решающую роль в IFN-опосредованном противовирусном иммунном ответе (50). Активация IRF3 во время продукции IFN-β имеет несколько ключевых этапов: фосфорилирование, димеризация и транслокация цитоплазмы в ядро. Ранее мы обнаружили, что HSV-2 ICP22 ингибирует индукцию IFN-β, противодействуя ассоциации IRF3 с промотором IFN-β без подавления фосфорилирования и ядерной транслокации IRF3 (22). В отличие от механизма, используемого HSV-2 ICP22, мы продемонстрировали в текущем исследовании, что HSV-2 ICP27 взаимодействует с IRF3 и препятствует активации IRF3, блокируя фосфорилирование IRF3 и ядерную транслокацию, тем самым подавляя продукцию IFN-β и ISG.Учитывая сложность генома HSV-2, содержащего более 70 генов, вполне вероятно, что несколько компонентов HSV-2, вероятно, способствуют подавлению индукции IFN типа I HSV-2. В самом деле, хотя наше текущее понимание уклонения от иммунитета HSV-2 ограничено, работа над HSV-1 выявила множество контрмер в подрыве выработки IFN типа I (17, 18). Путем конструирования и анализа усеченных мутантов HSV-2 ICP27 мы обнаружили, что область 1-138aa HSV-2 ICP27 является ключевым функциональным доменом, ответственным за опосредованное HSV-2 ICP27 снижение IFN-β.Напротив, исследование HSV-1 ICP27 показало, что его RGG-бокс, расположенный в области 139-152aa, является основной детерминантой, противодействующей цитозольной ДНК-стимулированной продукции IFN-β путем нацеливания на TBK1 и STING (30 ). Хотя HSV-2 ICP27 имеет 79% аминокислотной последовательности с HSV-1 ICP27, ключевым функциональным доменом, N-конец идентичен только на 65%, что может объяснить различия в биологических функциях. Например, по сравнению с HSV-1 ICP27, HSV-2 ICP27 менее эффективен в стимулировании цитоплазматической локализации ICP4, другого важного немедленного раннего белка HSV 1/2 (44).Кроме того, способность HSV-2 ICP27 ингибировать продукцию IFN-β оказалась намного сильнее, чем способность HSV-1 ICP27, когда ICP27 HSV-1 был заменен на HSV-2 ICP27 (30), что указывает на различие между ВПГ-2 ICP27 в ингибировании продукции IFN-β.

  В заключение, мы продемонстрировали, что HSV-2 ICP27 ингибирует индукцию IFN-β в тканях шейки матки человека, линиях цервиковагинальных эпителиальных клеток и первичных эпителиальных клетках слизистой оболочки человека. Далее мы рассмотрели основной механизм и предложили одну модель, основанную на пути RIG-I-MAVS-IRF3 (рисунок 7).Во время инфицирования HSV-2 эпителиальных клеток слизистой оболочки образуется ряд побочных продуктов, таких как вирусная дцРНК, которые могут распознаваться рецептором RIG-I. RIG-I связывается с дцРНК через домен геликазы и передает сигналы адаптеру MAVS через активацию каспаз и домены рекрутирования. Включение RIG-I инициирует передачу сигналов через два нижестоящих комплекса протеинкиназ, TBK-1 / IKK-ε, что приводит к фосфорилированию и димеризации IRF3. Димеры IRF3 перемещаются из цитоплазмы в ядро, чтобы связываться с промотором IFN-β и способствовать транскрипции IFN-β (51).С другой стороны, ранний белок HSV-2 ICP27 взаимодействует с IRF3 и препятствует фосфорилированию IRF3 и ядерной транслокации, тем самым ингибируя продукцию IFN-β и ISG. Наши результаты предоставляют важную информацию для понимания того, как ВПГ-2 ускользает от врожденного иммунитета слизистой оболочки и является потенциальной вирусной мишенью для вмешательства.

  Рисунок 7 . Схематическая модель механизма, с помощью которого HSV-2 ICP27 ингибирует продукцию IFN-β. ДцРНК HSV-2 обнаруживается с помощью RIG-I, который рекрутирует MAVS и нижестоящий комплекс TBK1 и IKK-ε.HSV-2 ICP27 взаимодействует с IRF3 и препятствует активации IRF3, блокируя фосфорилирование IRF3 и ядерную транслокацию, тем самым подавляя продукцию IFN-β и ISG.

  Авторские взносы

  QH задумал исследование. XG, MZ и MF проводили эксперименты. SL предоставила образцы тканей. XG, MZ и QH проанализировали данные. XG и QH написали рукопись. Все авторы рецензировали рукопись.

  Финансирование

  Работа поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81772192 и 81572009).

  Заявление о конфликте интересов

  Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

  Благодарности

  Мы благодарим доктора Дин Гао из основного центра и технической поддержки Уханьского института вирусологии Китайской академии наук за техническую помощь в конфокальной микроскопии и кинетическом анализе связывания.

  Дополнительные материалы

  Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: // www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2019.00290/full#supplementary-material

  Сокращения

  HSV-2, вирус простого герпеса 2 типа; SeV — вирус Сендай; Поли (I: C), полиинозин-полицитидиловая кислота; PEI, полиэтиленимин; DLR, отчет о двойной люциферазе; Co-IP, коиммунопреципитация; ОТ-ПЦР, количественная ПЦР в реальном времени; PRR, рецептор распознавания образов; TLR, Toll-подобный рецептор; RLR, RIG-I-подобный рецептор; ISG, стимулирующий ген IFN; FBS, фетальная бычья сыворотка; DMEM, среда Игла, модифицированная Дульбекко; ORF, открытая рамка считывания.

  Список литературы

  1. Джонстон К., Кори Л. Современные концепции инфекции вируса простого герпеса гениталий: диагностика и патогенез выделения из половых путей. Clin Microbiol Rev. (2016) 29: 149–61. DOI: 10.1128 / CMR.00043-15

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  3. Posavad CM, Zhao L, Dong L, Jin L, Stevens CE, Magaret AS, et al. Обогащение реактивных Т-клеток слизистой оболочки вируса простого герпеса 2 типа (HSV-2) в женских половых путях человека. Mucosal Immunol. (2017) 10: 1259–69. DOI: 10.1038 / mi.2016.118

  PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

  4. Всемирная организация здравоохранения. Рекомендации ВОЗ по лечению вируса простого генитального герпеса (2016).

  5. Lee Y, Dizzell SE, Leung V, Nazli A, Zahoor MA, Fichorova RN, et al. Влияние женских половых гормонов на восприимчивость к HSV-2 в вагинальных клетках, выращенных на границе раздела воздух-жидкость. Вирусов (2016) 8: 241.DOI: 10.3390 / v80

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Awasthi S, Hook LM, Shaw CE, Pahar B, Stagray JA, Liu D, et al. Трехвалентная вакцина против HSV-2 иммуногенна для макак-резусов и очень эффективна для морских свинок. PLoS Pathog. (2017) 13: e1006141. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1006141

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

11. Фицджеральд К.А., МакВиртер С.М., Файя К.Л., Роу, округ Колумбия, Латц Э., Голенбок Д.Т. и др.IKKepsilon и TBK1 являются важными компонентами сигнального пути IRF3. Nat Immunol. (2003) 4: 491–6. DOI: 10.1038 / ni921

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Мерфи А.А., Росато П.С., Паркер З.М., Халенков А.А., Лейб Д.А. Синергетический контроль патогенеза вируса простого герпеса с помощью IRF-3 и IRF-7, выявленных с помощью неинвазивной биолюминесцентной визуализации. Вирусология (2013) 444: 71–9. DOI: 10.1016 / j.virol.2013.05.034

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16.Пэн Т., Чжу Дж., Клок А., Фасук К., Хуанг М.Л., Коелле Д.М. и др. Уклонение от врожденного иммунитета слизистой оболочки вирусом простого герпеса 2 типа. J Virol. (2009) 83: 12559–68. DOI: 10.1128 / JVI.00939-09

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Охаши М, Бертке А.С., Патель А, Краузе ПР. Распространение вируса простого герпеса на спинной мозг не зависит от распространения на ганглии задних корешков. J Virol. (2011) 85: 3030–2. DOI: 10.1128 / JVI.02426-10

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20.Яо XD, Розенталь KL. Белок выключения вириона вируса простого герпеса 2 типа подавляет врожденные противовирусные пути дцРНК в эпителиальных клетках влагалища человека. J Gen Virol. (2011) 92: 1981–93. DOI: 10.1099 / vir.0.030296-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

21. Лу Х, Хуанг Ц., Чжан И, Лин И, Ван Х, Ли Кью и др. Продукт гена Us2 вируса простого герпеса 2 модулирует активацию NF-kappaB путем нацеливания на TAK1. Научный доклад (2017) 7: 8396.DOI: 10.1038 / s41598-017-08856-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Zhang M, Liu Y, Wang P, Guan X, He S, Luo S, et al. Белок немедленного раннего развития HSV-2 US1 ингибирует продукцию IFN-бета, подавляя ассоциацию IRF-3 с промотором IFN-бета. J Immunol. (2015) 194: 3102–15. DOI: 10.4049 / jimmunol.1401538

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Ли Х, Чжэн З., Чжоу П., Чжан Б., Ши З, Ху Ц. и др.Цистеиновый протеазный домен неструктурного белка 2 вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней противодействует активации фактора 3, регулирующего интерферон. J Gen Virol. (2010) 91: 2947–58. DOI: 10.1099 / vir.0.025205-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Ли С., Чжу М., Пан Р., Фанг Т., Цао Й.Й., Чен С. и др. Супрессор опухолей PTEN играет решающую роль в противовирусном врожденном иммунитете. Nat Immunol. (2016) 17: 241–9. DOI: 10.1038 / ni.3311

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

25. Qing G, Weili W, Fanqin Z, Rongchang Z, Yijin L, Jianqun D. Исследование UL54-специфической siRNA на репликацию вируса простого герпеса типа II. Int J Dermatol. (2011) 50: 362–6. DOI: 10.1111 / j.1365-4632.2010.04732.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

26. Du T, Hu K, Yang J, Jin J, Li C, Stieh D, et al. Бифункциональные гибридные белки CD4-DC-SIGN демонстрируют повышенную авидность к gp120 и подавляют инфекцию и распространение ВИЧ-1. Противомикробные агенты Chemother. (2012) 56: 4640–9. DOI: 10.1128 / AAC.00623-12

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

27. Като Х., Такеучи О, Сато С., Йонеяма М., Ямамото М., Мацуи К. и др. Различная роль геликаз MDA5 и RIG-I в распознавании РНК-вирусов. Nature (2006) 441: 101–5. DOI: 10.1038 / nature04734

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Лин Р., Нойс Р.С., Коллинз С.Е., Эверетт Р.Д., Моссман К.Л.RING-домен ICP0 вируса простого герпеса ингибирует опосредованную IRF3 и IRF7 активацию генов, стимулированных интерфероном. J Virol. (2004) 78: 1675–84. DOI: 10.1128 / JVI.78.4.1675-1684.2004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

29. Шнайдер ВМ, Шевиллотт Мэриленд, Райс СМ. Гены, стимулированные интерфероном: сложная сеть защитных механизмов хозяина. Ann Rev Immunol. (2014) 32: 513–45. DOI: 10.1146 / аннурев-иммунол-032713-120231

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30.Christensen MH, Jensen SB, Miettinen JJ, Luecke S, Prabakaran T., Reinert LS, et al. HSV-1 ICP27 нацелен на активированный TBK1 сигналсом STING, чтобы ингибировать индуцированную вирусом экспрессию IFN типа I. EMBO J. (2016) 35: 1385–99. DOI: 10.15252 / embj.201593458

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

31. Чиу YH, Macmillan JB, Chen ZJ. РНК-полимераза III обнаруживает цитозольную ДНК и индуцирует интерфероны типа I через путь RIG-I. Cell (2009) 138: 576–91.DOI: 10.1016 / j.cell.2009.06.015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

33. Демпси А., Боуи АГ. Врожденное иммунное распознавание ДНК: недавняя история. Вирусология (2015) 480: 146–52. DOI: 10.1016 / j.virol.2015.03.013

CrossRef Полный текст | Google Scholar

36. Эрикссон К., Свенссон А., Хаит А.С., Шлютер К., Тунбэк П., Нордстром И. и др. На переднем крае: генетическая ассоциация между однонуклеотидными полиморфизмами IFI16 и устойчивостью к генитальному герпесу коррелирует с уровнями экспрессии IFI16 и экспрессией IFN-бета, индуцированной HSV-2. J Immunol. (2017) 199: 2613–7. DOI: 10.4049 / jimmunol.1700385

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

37. Хуан Дж., Ю Х, Су Ц., Ли И, Чен С., Чжэн С. Тегументный белок VP22 вируса простого герпеса 1 отменяет cGAS / STING-опосредованный врожденный противовирусный иммунитет. J Virol. (2018) 92: e00841–18. DOI: 10.1128 / JVI.00841-18

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

38. Zhang J, Zhao J, Xu S, Li J, He S, Zeng Y, et al.Видоспецифическое дезамидирование cGAS белком UL37 вируса простого герпеса облегчает репликацию вируса. Клеточный микроб-хозяин (2018) 24: 234–48.e5. DOI: 10.1016 / j.chom.2018.07.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

42. Looker KJ, Elmes JAR, Gottlieb SL, Schiffer JT, Vickerman P, Turner KME, et al. Влияние инфекции HSV-2 на последующее заражение ВИЧ: обновленный систематический обзор и метаанализ. Lancet Infect Dis. (2017) 17: 1303–16.DOI: 10.1016 / S1473-3099 (17) 30405-X

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

43. Визи Р.С., Пилч-Купер Х.А., Хоуп Т.Дж., Альтер Дж., Кариас А.М., Сипс М. и др. Профилактика передачи SHIV с помощью местного лечения IFN-β. Mucosal Immunol. (2016) 9: 1528. DOI: 10.1038 / mi.2015.146

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

44. Park D, Lalli J, Sedlackova-Slavikova L, Rice SA. Функциональное сравнение гомологов ICP27 вируса простого герпеса 1 (HSV-1) и HSV-2 показывает роль ICP27 в высвобождении вириона. J Virol. (2015) 89: 2892–905. DOI: 10.1128 / JVI.02994-14

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

45. Tang S, Patel A, Krause PR. ICP27 вируса простого герпеса регулирует альтернативное полиаденилирование и сплайсинг пре-мРНК зависимым от последовательности образом. Proc Natl Acad Sci USA (2016) 113: 12256–61. DOI: 10.1073 / pnas.1609695113

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

46. Тунниклифф РБ, Шахт М., Леви К., Йовитт Т.А., Сандри-Голдин Р.М., Голованов А.П.В структуре свернутого домена сигнатурного многофункционального белка ICP27 вируса простого герпеса-1 обнаружен переплетенный димер. Научный доклад (2015) 5: 11234. DOI: 10.1038 / srep11234

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

47. Джонсон К.Е., Сонг Б., Книп Д.М. Роль ICP27 вируса простого герпеса 1 в ингибировании передачи сигналов интерферона типа I. Вирусология (2008) 374: 487–94. DOI: 10.1016 / j.virol.2008.01.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

48.Мельхьорсен Дж., Сирен Дж., Джулкунен И., Палудан С.Р., Матикайнен С. Индукция экспрессии цитокинов вирусом простого герпеса в макрофагах и дендритных клетках человека, полученных из моноцитов, зависит от репликации вируса, и ей противодействует ICP27, нацеленный на NF-kappaB и IRF-3 . J Gen Virol. (2006) 87: 1099–108. DOI: 10.1099 / vir.0.81541-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

49. Burdette DL, Monroe KM, Sotelo-Troha K, Iwig JS, Eckert B, Hyodo M, et al.STING — это датчик прямого врожденного иммунитета циклического ди-GMP. Nature (2011) 478: 515–8. DOI: 10.1038 / nature10429

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

50. Негиси Х., Танигучи Т., Янаи Х. Класс цитокинов интерферона (IFN) и семейство факторов транскрипции фактора регуляции IFN (IRF). Колд Спринг Харб Перспект Биол . (2017) 10: a028423. DOI: 10.1101 / cshperspect.a028423

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

51.Wang P, Zhao W., Zhao K, Zhang L, Gao C. TRIM26 негативно регулирует продукцию интерферона-бета и противовирусный ответ посредством полиубиквитинирования и деградации ядерного IRF3. PLoS Pathog. (2015) 11: e1004726. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1004726

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Как Covid отправляет некоторые тела на войну с собой

Жанель Эйрес, физиолог, специализирующаяся на инфекционных заболеваниях из Института биологических исследований Солка, описывает эту концепцию как «механизм устойчивости к болезням» — способность, иногда жестко запрограммированную, иногда индуцированную. факторами окружающей среды, чтобы выжить при инфекциях и не заболеть.«Наша традиционная точка зрения заключалась в следующем: чтобы пережить инфекцию, ее нужно убить», — сказала она мне. «У нас очень ориентированный на болезнь подход к биологии». Но инфекция не всегда означает болезнь. Многие из самых пугающих патогенов — туберкулез, холера, полиомиелит, а теперь и коронавирус — не вызывают болезни у каждого, кого заражают. Некоторые люди испытывают эти инфекции практически без симптомов. Их иммунная система, очевидно, справляется с вторжением с идеальным балансом агрессии, сдерживания и восстановления — или терпимости — чтобы предотвратить болезнь.Эйрес надеется, что лекарства будущего позволят задействовать эти естественные механизмы толерантности, которые помогут некоторым избавиться, с небольшими негативными последствиями, от болезней, которые вызывают тошноту и убивают других.

Пандемия Covid-19 уже побудила многих врачей склониться в этом направлении. Существует так мало инструментов для надежного удаления вируса из нашего организма, что они по необходимости обратились к идее стимулировать иммунную систему различными способами. Они сместили акцент в манере, которую Эйрес долгое время считал необходимостью: от искоренения патогена к помощи пациенту в его выживании.В каком-то смысле они возлагают надежды на врожденные механизмы толерантности.

В настоящее время проводятся десятки испытаний , направленных на иммунную систему. Они включают в себя все, от дешевых обезболивающих до дорогих антител, производимых в живых клетках. К лекарствам, которые они испытывают, относятся анакинра, используемая Наварро-Милланом; леронлимаб, препарат с противовоспалительными свойствами, первоначально разработанный для лечения ВИЧ; и препараты, блокирующие ИЛ-6 (полное раскрытие: моя жена работает в компании Genentech, принадлежащей компании Рош, которая производит тоцилизумаб, один из блокаторов ИЛ-6).В одном из исследований, проведенных в Великобритании, тестируются высокие дозы нестероидного противовоспалительного ибупрофена, более известного в Соединенных Штатах как Адвил, благоприятного для желудка препарата. (Не пытайтесь делать это дома.) Исследователи даже изучают низкие дозы рентгеновского излучения как способ успокоить иммунную систему, метод, который использовался в начале 20-го века для лечения пневмонии, но с тех пор вышел из употребления. использовать.

Есть интригующее испытание старого лекарства, первоначально разработанного для лечения подагры, болезненного воспалительного состояния суставов, под названием колхицин.Препарат, который, как недавно было показано, обеспечивает защиту от сердечных приступов, нацелен на самый путь, называемый инфламмасомой NLRP3, который, по мнению некоторых ученых, естественным образом ослаблен у летучих мышей. В отличие от биопрепаратов, которые вводятся внутривенно, колхицин можно принимать в виде таблеток. И хотя биопрепараты могут стоить сотни долларов за дозу, колхицин очень дешев. «Мы думаем, что в условиях этой вирусной инфекции NLRP3 активируется аберрантно», — говорит Присцилла Сюэ, профессор медицины в U.C.S.F. и один из врачей, наблюдающих за испытаниями. «И это ведет к плохим результатам». Есть надежда, что это лекарство предотвратит то, что иммунная система когда-либо станет чрезмерно активированной. Исследование направлено на то, чтобы начать лечение как можно раньше, отправив таблетки на дом пациентам с положительным результатом на Covid-19. «Мысль заключается в том, что если мы сможем вмешаться на ранней стадии с помощью противовоспалительного средства, мы сможем замедлить прогрессирование и удержать пациентов от ИВЛ», — говорит Сюэ.

Еще неизвестно, какой препарат будет работать лучше всего, и каковы могут быть непредвиденные последствия подавления иммунной системы в разгар борьбы с коронавирусом. Некоторые испытания уже показывают неудачи. Несмотря на обнадеживающие результаты ранних, слабых исследований, два из самых сильных на сегодняшний день испытаний блокаторов ИЛ-6 тоцилизумаба и сарилумаба не предполагают никаких преимуществ. (Фармацевтические компании Roche и Regeneron, проводящие исследования, продолжают другие испытания своих блокаторов IL-6.)

Или, может быть, исследования дали бы лучшие результаты, если бы они были спланированы иначе. Томас Ядегар, который считает, что тоцилизумаб может спасти жизнь при правильном применении, предполагает, что в одном исследовании не использовались достаточно строгие критерии для отбора пациентов. Наварро-Миллан считает, что в ходе испытаний пытались лечить пациентов слишком поздно в ходе болезни. Она сравнила эти усилия с попыткой вылечить метастатический рак 4 стадии — вероятно, обреченный с самого начала.

Другие исследователи также поднимают вопрос о сроках — когда врачи должны назначать лекарства для сдерживания иммунных реакций — в более общем смысле.Подавление иммунной системы слишком быстро после заражения может быть контрпродуктивным, поскольку оно может подавить первоначальный противовирусный ответ и позволить коронавирусу размножаться, говорит Дон Вахези, детский ревматолог из Детской больницы в Монтефиоре. Однако слишком позднее лечение может сделать невозможным подавление возможной чрезмерной иммунной реакции. «Знание того, когда настало подходящее время, — я думаю, это один из ключевых компонентов», — сказал мне Вахези. «Есть очень тонкое окно, в котором могут помочь иммуномодуляторы.”

Объяснение иммунного ответа на COVID

Найдите последние новости и рекомендации о COVID-19 в Центре ресурсов по коронавирусу Medscape.

Эта стенограмма отредактирована для ясности.

Эрик Дж. Тополь, MD: Здравствуйте. Меня зовут Эрик Тополь, и я с Абрахамом Вергезе для нового издания «Медицина и машина» . Сегодня это особое удовольствие — поговорить с Акико Ивасаки, профессором иммунобиологии Йельского университета.Добро пожаловать, Акико. Рад видеть тебя с нами.

Акико Ивасаки, доктор философии: Большое спасибо, Эрик. Я очень рад быть здесь.

Topol: История Акико очень интересна. Она приехала из Японии в Канаду, получила степень бакалавра и доктора философии в Университете Торонто, работала пост-доктором в Национальном институте здравоохранения США и проработала в Йельском университете 20 лет. Она стипендиат Медицинского института Говарда Хьюза и избранник Национальной академии наук.Она стала моим иммунобиологом через Twitter, свои статьи и видео. Фактически, ближе к концу июля она разместила на YouTube «Иммунология 101», которую нельзя не посетить.

До COVID самыми ценными талантами были аналитики данных. Теперь им стали иммунологи. Акико, я знаю, что вы тратите много усилий на врожденный иммунитет и интерфероны (IFN), но можете ли вы дать нам общее представление о двух основных компонентах иммунного ответа на SARS-CoV-2?

Ивасаки: Вы правы.В связи с этой пандемией иммунология стала весьма актуальной. И я пытаюсь не только проводить исследования иммунитета к COVID, но и информировать общественность об иммунной системе и о том, как она работает.

Наша иммунная система состоит из двух разных слоев. Первый слой — это врожденная иммунная система, которая действует в течение нескольких минут после заражения, обеспечивая своего рода быструю реакцию. Это не требует какой-либо конкретики; занимается после любого вида инфекции. Но эта врожденная активация важна для запуска второго слоя иммунной системы, которым является адаптивная иммунная система.В адаптивной иммунной системе ключевыми игроками являются В-клетки и Т-клетки; со временем они приобретают специфичность и память, которые являются основой прививок. Очень важно иметь те Т- и В-лимфоциты, которые специфичны для определенного патогена и обеспечивают долгосрочную реакцию памяти.

Topol: Одна вещь, которая возникла недавно, — это своего рода паника, когда некоторые говорили, что реакция антител, которая была протестирована на нескольких разных сериях пациентов, выздоровевших от COVID, похоже, со временем уменьшалась.Возможно, это была ложная тревога. Может быть, вы можете поместить это в контекст.

Ивасаки: Я не обвиняю людей в том, что они беспокоятся по этому поводу, потому что долголетие иммунного ответа — это то, на что мы рассчитываем для защиты всего населения. Вот что должны делать вакцины. Если вы будете следить за пациентами, инфицированными COVID, через какое-то время, их уровень антител, похоже, в какой-то степени снизится в течение 2-3 месяцев. Но это не повод для беспокойства, потому что именно это происходит, когда вы заражаетесь или когда вам впервые делают прививку.Уровень антител достигает пика в течение первых двух недель, а затем, в конечном итоге, снижается в течение нескольких месяцев. Это нормально, потому что у вас все еще есть В-клетки памяти, специфичные для этого антигена, а также Т-клеточный иммунный ответ на вирусный антиген. Таким образом, во второй раз, когда вы подвергнетесь воздействию того же вируса, у вас может возникнуть быстрый, специфический и устойчивый иммунный ответ. Скорее всего, вы ничего не почувствуете во второй раз, когда заразитесь. Это будет довольно легкая или бессимптомная инфекция.

Я хочу прояснить, что снижение уровня антител само по себе не является серьезным поводом для беспокойства.Второй момент, который я хочу отметить, заключается в том, что с вакцинами мы обычно вводим бустерные вакцины, которые стимулируют гораздо более сильный и длительный иммунитет. Этот иммунитет следует сохранять годами. Итак, опять же, уменьшение реакции антител на естественную инфекцию не должно вызывать серьезных опасений при проведении вакцинации.

Topol: Это очень обнадеживает. Здесь очень много разных аспектов, в которых играет роль иммунология. Одна из особенно интересных областей — и она в некоторой степени связана с вашей недавней статьей в Nature , в которой вы охарактеризовали различные реакции у людей с умеренным и тяжелым заболеванием, — это недостаточный ответ IFN у некоторых людей, и может ли это быть раннее усиление некоторым типом IFN.Однако это сложно, потому что существует не только один тип IFN, и время отчасти похоже на Златовласку — вы должны получить его как следует. Где мы находимся? Я знаю, что несколько клинических испытаний ИФН типа I продолжаются.

Ивасаки: Как вы говорите, IFN типа I необходимо вводить в нужное время с правильной дозой и правильным типом. Выводы, в том числе из нашего собственного исследования, заключаются в том, что длительный уровень IFN типа I, особенно на поздних стадиях заболевания, может быть связан с худшим исходом заболевания.Так что давать пациентам с COVID рекомбинантный IFN на поздних стадиях заболевания, вероятно, не будет хорошей идеей. В то время как использование рекомбинантного IFN в качестве профилактики инфекции или если вы можете поймать пациентов на очень ранней стадии инфекции и дать достаточно IFN для остановки репликации вируса, эти стратегии являются многообещающими. Я жду, что произойдет в клинических испытаниях. Но я думаю, что раннее время и введение достаточной дозы, чтобы заблокировать репликацию вируса, будут ключевыми в будущем.

Topol: В журнале « Nature Reviews Immunology » только что вышла статья, в которой рассматриваются четыре небольших текущих испытания и это многоцентровое исследование из Китая.Все они выглядят многообещающе. Если бы вы предсказывали будущее, представляете ли вы, что у всех нас может быть ингалятор с IFN, который мы будем принимать при первом диагнозе или воздействии? Как вы думаете, это возможно?

Ивасаки: Пока мы можем давать правильную дозу без токсичности, это может быть будущее, особенно в профилактических целях. Например, если у члена вашей семьи диагностирована вирусная инфекция, вы потенциально можете лечить остальных членов семьи профилактическим интерфероном, а также медицинских работников или людей, которые ежедневно подвергаются воздействию высоких доз вируса.Вот что произошло в Китае; они вводили ингаляционный интерферон медицинским работникам, и никто из них не был инфицирован. Так что это может быть хорошим делом в будущем.

Verghese: Акико, у тебя прекрасный способ объяснять очень сложные вещи простым способом. Я врач-инфекционист, но должен сказать, что способ описания цитокинов и цитокинового шторма вызывает такое недоумение. Можете ли вы помочь понять, на что мы должны обращать внимание во всех различных цитокинах и почему?

Iwasaki: Ненавижу добавлять к этому недоумению, но типичный цитокиновый шторм, о котором сообщалось, включает IL-1, IL-6, фактор некроза опухоли, такого рода острые врожденные цитокины.Но в нашем недавнем отчете мы также обнаружили цитокины, которые принадлежат к совершенно разным типам иммунных ответов, например, те, которые предназначены для грибкового ответа или ответа гельминтов — иммунные ответы типа III и типа II. Таким образом, в тяжелых случаях иммунная система выглядит сбитой с толку и дезориентированной, вырабатывая все типы цитокинов, которые также вызывают своего рода бурю. Я думаю, что болезнь COVID может начаться с типичного цитокинового шторма, а затем распространиться на различные типы торнадо, ураганов и все виды неправильных иммунных реакций.

Topol: Все нерегулируется. Кажется, что по большей части люди — если у них нет других ударов, таких как тромбоэмболия легочной артерии или что-то еще — цитокиновый шторм является основной причиной смерти с точки зрения фактического механизма. Пока что единственное, что нам нужно блокировать, это дексаметазон. Но это не имеет исключительной эффективности. Нам нужно улучшить весь этот процесс.

Еще одна важная тема сейчас — «затяжной COVID.«Вы применили систематический подход ко всему спектру заболевания, от легкой до очень тяжелой или критической; длительный COVID кажется следующей главой. На сегодняшний день опубликовано очень мало иммунологических исследований. Но с болью в суставах, сильной усталостью , и многие другие признаки и симптомы, это похоже на иммунологическое заболевание. Что вы думаете по этому поводу?

Ивасаки: Абсолютно согласен. Длительный COVID является довольно загадочным с точки зрения того, что является причиной такого длительного заболевания.Кроме того, симптомы у этих пациентов, по-видимому, меняются в ходе пост-контакта с COVID. У меня есть три гипотезы, чтобы объяснить это, но это также может быть их комбинация. Первая гипотеза заключается в том, что где-то скрывается резервуар вируса, который периодически активируется и реактивируется, вызывая подобные реакции. Мазки из носоглотки, которые мы в настоящее время используем для тестирования на вирус, не способны выявить такие резервуары.

С этим связана вторая гипотеза.Возможно, это не резервуары инфекционного вируса, а частички вирусной РНК или белка, которые задерживаются где-то в организме, что активирует иммунный ответ против вируса и вызывает эти изменчивые и продолжительные симптомы. Третья гипотеза заключается в том, что инфекция вызывает аутоиммунное заболевание. Возможно, вирус имитирует аутоантигены или вирусную инфекцию, будучи в данном случае воспалительным, и вызывает аутореактивные Т- и В-клетки. Мы пытаемся понять, какая из этих возможностей верна.Но, возможно, все это происходит одновременно.

Topol: С аутоиммунитетом, возможно, не так уж сложно бороться, но как вы можете добраться до резервуара вируса или фрагментов РНК, которые каким-то образом создают или поддерживают удар?

Ивасаки: Некоторые выводы являются результатом отчетов о вскрытии трупов пациентов, переболевших COVID и скончавшихся. У нас не так много информации о вскрытиях от «дальнобойщиков».Но, по крайней мере, расследование этих вскрытий после острой инфекции выявляет инфекцию во многих частях тела, включая, очевидно, легкие, а также кишечник и многие другие места. Результаты вскрытия покажут, скрываются ли в этих органах остатки вируса или потенциально инфекционного вируса.

Topol: Это то, что нам нужно предотвратить. Вроде бы не редкость. Что касается сохранения вируса, то многие из рассмотренных мной случаев остаются положительными на ПЦР через несколько недель и месяцев.Так что есть что-то, что наверняка согласуется с этой гипотезой. В некоторой степени связан мультисистемный воспалительный синдром у детей (MIS-C). Очевидно, что это вариант Кавасаки, но он отличается от детей постарше, возможно, с большим вовлечением сердца и других органов. И это похоже на воспалительную историю аутоиммунного типа. Что ты думаешь об этом?

Ивасаки: Чтобы понять, участвует ли аутоиммунитет, нам необходимо идентифицировать аутоантигены.Я знаю, что над этим работают многие группы, но в настоящее время мы действительно не знаем взаимосвязи между воздействием COVID и развитием аутоантител или даже аутореактивных Т-клеток, которые могут вызывать эти типы воспалительных заболеваний. Так что идентификация антигена-виновника будет ключевой.

Verghese: У вас есть изящная бумага на модели мыши для COVID, которая была бы прекрасным способом выявить отдельные элементы этой болезни. Если хотите, поговорите о разработке этой модели и о том, что вы видите в качестве ее будущих приложений.

Ивасаки: Спасибо, что подняли этот вопрос. Созданная нами модель мыши представляет собой очень простую в использовании и универсальную модель, в которой мы трансдуцировали мышей с помощью аденоассоциированного вируса (AAV), кодирующего человеческий ACE2. Его универсальность обусловлена ​​тем, что вы можете использовать любые фоновые животные, будь то нокаутные, трансгенные или репортерные мыши. Вам просто нужно трансдуцировать мышей с помощью AAV в течение 14 дней и до тех пор, пока экспрессия ACE2 не станет полностью развитой. Затем вы можете заразить этих животных SARS-CoV-2 человека.

Эта публикация отражает начало того, что мы сделали. Мы изучаем все виды участников иммунного ответа, разные типы клеток, разные цитокины и их связь с защитой от этого вируса, а также патологию, возникающую в результате активации иммунной системы. В этой первой статье мы смогли изучить роль IFN типа I, возвращаясь к вопросу Эрика, и показали, что, по крайней мере, в модели на мышах, IFN типа I, по-видимому, неспособен блокировать репликацию вируса.Если вы посмотрите на титр вируса у животных, которые относятся к дикому типу или к нокауту IFN-рецепторов, титры не сильно различаются в разные дни заражения. Разница в патологии, которую мы видим в этой линии. IFN типа I индуцирует множество хемокинов, которые привлекают лейкоциты в легкие. К сожалению, это как бы разжигает огонь, набирая лейкоциты в легкие, и в то же время не очень компетентно в блокировании репликации вируса.

Этот вид имитирует то, что мы обнаружили у людей, а именно этот долгосрочный, тлеющий ответ IFN типа I, связанный со смертностью и продолжительностью пребывания в больнице.У животных мы наблюдаем то же самое: эндогенный IFN не очень способен блокировать репликацию вируса и вместо этого приводит к патологическим эффектам. Это первое понимание, которое мы можем наблюдать параллельно, от человека к мыши и от мыши к человеку. Теперь мы смотрим на другие типы иммунных ответов и на то, способствуют ли они также патологии или защите.

Verghese: Считаете ли вы, что это проблема с уровнем IFN или это качественный дефект в способности IFN справляться с этим конкретным вирусом?

Ивасаки: Вероятно, это смесь.Вероятно, мы не получаем устойчивого IFN-индуцированного ответа, потому что SARS-CoV-2 кодирует многочисленные механизмы уклонения, чтобы блокировать индукцию IFN и даже передачу сигналов рецептора IFN в целом. Вот почему, когда мы выбиваем рецептор IFN у хозяина, мы не видим большой разницы в биорепликации. Это говорит о способности этого вируса уклоняться от IFN-ответа и как бы подавлять его. Вот почему может иметь смысл раннее начало лечения рекомбинантным интерфероном.

Topol: До тех пор, пока он каким-то образом не будет подавлен этим очень неуловимым и сложным вирусом.

Одна из вещей, которую вы однозначно отстаиваете, — это то, что мы не уделяем достаточно внимания иммунитету слизистых оболочек, иммуноглобулину А (IgA). Почти все из этих 200 программ вакцинации работают над уколами протеина или какого-либо компонента вируса, чтобы обеспечить реакцию антител и Т-клеток. Но есть и другой путь к иммунитету слизистых оболочек. Может быть, вы могли бы рассказать нам больше об ответе IgA и почему вы думаете, что этому не уделяется достаточно внимания.

Ивасаки: Из-за характера этой пандемии люди пытаются разработать вакцину как можно скорее, что важно для нас, чтобы вернуться в нормальное общество. Поэтому я думаю, что первые поколения вакцин будут теми, которые вырабатывают наиболее устойчивые нейтрализующие антитела в обращении. Это имеет огромное значение для предотвращения дальнейшего распространения этого вируса. Но если потратить немного времени и больше усилий, люди также начинают изучать вакцины для слизистых оболочек и, возможно, вводить такую ​​же вакцину через нос, а не в мышцы.Когда эти вакцины будут протестированы бок о бок, я считаю, что мы увидим разницу в обеспечении стерилизующего иммунитета слизистой оболочки и в подавлении болезни после заражения. Меня не обескураживает тот факт, что эти вакцины разрабатывают системную вакцинацию. Но в будущем, я думаю, нам следует больше уделять внимание вакцинам для слизистых оболочек.

Тополь: Как вы думаете, они будут дополнять друг друга? Вакцины, которые находятся в стадии быстрой разработки, фазы 3 испытаний, не будут предотвращать инфекцию или обеспечивать стерилизацию, но будут модулировать ответ, тогда как антитела IgA могут фактически в первую очередь блокировать инфекцию.Могут ли они когда-нибудь быть в паре?

Ивасаки: Думаю, да. Но если системные вакцины обеспечивают надежную блокировку болезни, это было бы отличным первым началом. Кстати, стерилизация иммунитета — не цель большинства вакцин.

Topol: Некоторые вакцины в испытаниях заявляют об этом в своих статьях на моделях нечеловеческих приматов. Этого не нужно добиваться. Но интересно, как это утверждается прямо сейчас.

Генетик Джордж Черч недавно ввел вакцину для слизистых оболочек с помощью назального спрея. И ее критиковали, потому что она похожа на российскую вакцину — нет профиля безопасности. Но Джордж — настоящий пионер. Было бы интересно получить реальные результаты от группы людей, которые тестируют эту вакцину.

Один из спорных вопросов сейчас — это так называемый эффективный коллективный иммунитет, естественный иммунитет, который обсуждается. Большинство экспертов сходятся во мнении, что для установления коллективного иммунитета необходимо добиться иммунитета у 70% или 80% людей.Но недавно мы наблюдали случаи заражения в Соединенных Штатах, особенно в сильно пострадавших штатах, таких как Техас, Аризона и Флорида, где по какой-то особой причине, похоже, что число инфицированных снижается, а не только потому, что есть меньше тестирования, что является еще одной проблемой. Это привело к тому, что некоторые люди предположили, что, возможно, эти 20% инфицированных людей обеспечивают меньшее распространение. Что вы думаете об этом? Объяснение уменьшения числа случаев?

Ивасаки: Во-первых, я должен сказать, что я не занимаюсь математическим моделированием.Я могу поделиться своими мыслями только как иммунолог. На данном этапе немного опасно полагаться на коллективный иммунитет для открытия общества, потому что коллективный иммунитет требует, чтобы значительная часть населения имела иммунитет к вирусу. Даже если есть сообщество, в котором 20% людей имеют иммунитет, мы не знаем, как долго он продлится, потому что они приобрели его в результате естественной инфекции. Мы просто недостаточно знаем о защитном уровне антител и Т-клеток у людей, выздоравливающих от этой инфекции, чтобы знать, как долго продлится такой защитный иммунитет.Кроме того, каждый человек может немного отличаться. Я считаю, что преждевременно и опасно полагаться на эти цифры без вакцины, которую можно было бы распространить среди населения.

Verghese: Знаете, прежде чем мы оставим врожденный иммунитет, у меня есть вопрос, который может показаться наивным, но я знаю, что вы эксперт по иммунитету слизистых оболочек. Вначале некоторые мудрые люди из кухонной раковины предлагали полоскать горло и использовать носовые полоскания в качестве профилактики, потому что, если вирус собирается прикрепиться, это первый шаг.Есть ли в этом какая-то логика? Может ли это быть стратегией до того, как у нас действительно появится иммунитет на местном уровне? Стратегия заключалась бы в том, чтобы каким-то образом заблокировать прикрепление вируса к рецепторам в носоглотке.

Ивасаки: Я не уверен, от какого количества солевого раствора для носа можно избавиться. Однако я сторонник влажности. Мы опубликовали модель мыши, изучающую роль влажности в наших дыхательных путях и иммунитет к вирусу гриппа. Мы увидели, что относительная влажность 40-60% помогает животному удалять вирус из дыхательных путей посредством мукоцилиарного движения.В то время как если вы держите мышей при влажности 20%, которую вы найдете в помещении в зимние месяцы, у этих животных дела шли плохо, потому что они не могли избавиться от вируса. Таким образом, существует естественный механизм удаления вируса, которым мы можем воспользоваться, поддерживая относительную влажность на определенном уровне.

Topol: Возвращаясь к вакцинам, мы очень беспокоились о том, какой должна быть цель. Некоторые вакцины-кандидаты вызывают относительно слабый Т-клеточный ответ, особенно Т-лимфоциты CD8, тогда как другие вызывают.Что бы вы вообразили как идеальный ответ, если бы вы взглянули на вакцину и попытались спроецировать, что она обеспечит надежную защиту? Что вы думаете об этом?

Ивасаки: Если вакцина может вызывать очень высокие уровни нейтрализующих антител, это в значительной степени блокирует распространение вируса среди человека. Т-клеточный иммунитет может вообще не понадобиться, то есть Т-лимфоциты CD8. Конечно, чтобы достичь такого уровня антител, вам нужна была помощь Т-лимфоцитов CD4.Так что по умолчанию такая вакцина вызвала бы очень хороший иммунитет к Т-хелперам. Но нужны ли вам устойчивые CD8-ответы, нейтрализующие антитела и для обеспечения защиты — вопрос открытый. Я не уверен, что они нам нужны оба. Если бы вы видели только ответ Т-лимфоцитов CD8, вы не смогли бы добиться очень быстрого избавления от вируса, потому что антитела необходимы, чтобы действительно блокировать распространение вируса. CD8 Т-клетки отлично справляются с задачей уничтожения фабрик по производству вирусов, но они не собираются полностью предотвратить инфекцию.С точки зрения важности, это высокий титр нейтрализующих антител, и если есть устойчивый ответ CD8, это своего рода вишенка на торте.

Topol: Большинство вакцин-кандидатов имеют довольно хороший профиль нейтрализации ответа антител, так что это обнадеживает. Можете ли вы сделать какие-либо выводы из эпидемии атипичной пневмонии и того, что сработало тогда, если существует аналогичная структура? У некоторых людей, переболевших атипичной пневмонией, по-видимому, все еще есть признаки иммунитета к атипичной пневмонии.

Iwasaki: Несколько вакцин были изучены во время вспышки SARS-CoV-1.Некоторые вакцины работали очень хорошо, а другие, к сожалению, вызывали непреднамеренное усиление болезни. Например, вакцина от дважды инактивированного вируса SARS-CoV-1 вызвала ответ антителозависимого усиления (ADE). Но меня воодушевляет то, что даже эти виды инактивированных вакцин против SARS-CoV-2 вызывают довольно устойчивые нейтрализующие реакции антител без признаков ADE. До сих пор ни одна из вакцин-кандидатов не сообщала о каких-либо серьезных побочных эффектах или эффектах типа ADE.

Topol: Повышение уровня антител является первостепенной задачей. Верите ли вы в это, или заболевание, связанное с иммунным комплексом, не будет большой проблемой в будущем, или, по крайней мере, только в очень редких случаях?

Ивасаки: Это моя надежда. Первые две фазы клинических испытаний не сообщили ни о каком из этих эффектов; однако на самом деле именно в ходе испытаний фазы 3 мы выясняем, есть ли побочные эффекты в редких случаях и почему. Вот почему так важно не торопить этот процесс.

Topol: Мы отметили большой разрыв между мужским и женским риском COVID-19. Можете ли вы сказать нам, что, по вашему мнению, вызывает эту разницу?

Ивасаки: Мы активно изучаем половые различия в иммунитете к COVID-19. На данный момент мы обнаружили, что пациенты мужского пола, у которых развивается тяжелая форма COVID, обычно имеют очень низкую активацию Т-клеток, тогда как пациенты женского пола, у которых развивается тяжелая форма COVID, имеют повышенные цитокины врожденного иммунитета. Таким образом, похоже, что женщины и мужчины по-разному реагируют на вирус.Отсутствие Т-клеточного иммунитета у мужчин интересно, потому что, когда мы смотрим на возраст по оси X и активацию Т-клеток по оси Y, мы видим зависимое от возраста снижение активации Т-клеток у мужчин, но не у женщин. . Так что это может иметь какое-то отношение к тому, почему у инфицированных мужчин более тяжелое заболевание.

Topol: Похоже, что среди дальнобойщиков преобладают женщины с COVID. Вы связались с этим?

Iwasaki: Заманчиво предположить о связи между аутоиммунитетом и этими «дальнобойными», потому что подавляющее большинство аутоиммунных заболеваний преобладают у женщин по сравнению с мужчинами.Из трех перечисленных мной гипотез аутоиммунное заболевание может возникать у женщин и может способствовать развитию болезни дальнего следования. Но без каких-либо данных я не хочу строить догадки.

Topol: Я думаю, мы просили вас много размышлять, и это весело. Приятно слышать ваше мнение.

Я хочу спросить вас о детях. Мы говорили о MIS-C, но не говорили обо всем этом противоречии сейчас, когда школы снова открываются и что у детей меньше шансов заболеть.Возможно, их передача меньше. Во всем этом было много путаницы. Что вы думаете о неизвестном в детях по сравнению со взрослыми? И есть ли разница между детьми младшего и старшего возраста?

Ивасаки: Определенно существует возрастной градиент симптомов, связанных с воздействием SARS-CoV-2. Но симптомы не имеют отношения к тому, заразны ли они. У детей может быть высокий титр реплицирующегося вируса в носу даже без симптомов.Станут ли они распространителями, не зная, что заражены, — это реальная возможность. У меня двое детей, и они очень хотят вернуться в школу; им так надоело проводить все лето с родителями. Так что я полностью понимаю. И для их психического здоровья важно, чтобы они были с другими детьми. Но меня беспокоит их способность передавать вирус, даже если у них нет симптомов.

Topol : Это поднимает вопрос об их предыдущем контакте с простудными коронавирусами и о том, что у детей может быть уже существующий Т-клеточный иммунитет.Возможно, это происходит чаще у детей, чем у взрослых, отчасти потому, что существует временной разрыв между тем, когда взрослые могли подвергнуться простуде до коронавируса, и тем временем, когда дети были подвержены воздействию. Вы в Нью-Хейвене, штат Коннектикут. В плане распространения там довольно тихо. Вы чувствуете себя лучше из-за того, что дети ходят в школу, и из-за отсутствия передаточной цепи в таком месте, как Коннектикут?

Ивасаки: На данный момент у нас мало случаев, и это прекрасно.Но внутри страны происходит много поездок из штатов с высоким числом заболевших в штаты с низким числом случаев, даже несмотря на то, что существует своего рода карантин. Поэтому трудно понять, когда мы почувствуем себя в безопасности, потому что распространение может происходить, даже не подозревая об этом. На то, чтобы цифры действительно появились, требуется пара недель. Я определенно чувствую себя лучше, чем был в апреле, но в то же время я по-прежнему проявляю максимальную осторожность.

Topol: Будут ли ваши дети посещать виртуальные классы или они будут ходить в школу физически?

Ивасаки: Они были бы очень расстроены, если бы я сказал, что они могут работать только виртуально.Прямо сейчас планируется открытие школы, и у них будут очные занятия. Но это нестабильная ситуация. Я слежу за тем, что сейчас происходит.

Verghese: Я просто хотел уточнить личную заметку. Изначально, в марте, все исследовательские лаборатории были закрыты, а постепенно их пытаются открыть. Но со всеми проблемами, связанными с наличием людей в одном помещении, как вы управляли своей исследовательской лабораторией? Вы были невероятно продуктивны. Расскажите нам о проблемах на работе.

Ивасаки: Я лично давно не был на своем рабочем месте, чтобы обеспечить достаточно места для работы сотрудников моей лаборатории. Мы действительно закрылись довольно агрессивно в середине марта. Единственным разрешенным типом исследований были исследования, связанные с COVID, поэтому, несмотря на то, что университет закрылся, моя лаборатория продолжала работать. Фактически, они работали усерднее, чем когда-либо, пытаясь изучить иммунный ответ в режиме реального времени. Моя лаборатория упорно работает, но она также следует рекомендациям по физическому дистанцированию и уплотнению.У нас не могло быть одновременной работы всех сотрудников лаборатории; в каждом отсеке должен был быть один человек, так что это действительно замедляло нас, потому что мы не могли быть все там. К счастью, все практиковали физическое дистанцирование и использовали средства индивидуальной защиты, поэтому в течение этого времени никто не подвергался воздействию вируса.

Topol: Давайте ненадолго оставим пандемию и узнаем больше о тебе, Акико. У тебя была потрясающая карьера. Ваш отец был физиком, ваша мать была активисткой, отстаивающей права женщин.Как они повлияли на вас в других вещах, которые происходили в вашей карьере, чтобы вы стали тем, чем вы являетесь сегодня?

Ивасаки: Они оказали на меня огромное влияние. Я выросла в Японии и увидела, как много моей матери приходится бороться, чтобы даже продолжать работать, по-настоящему научила меня важности высказывания и веры в себя как в женщину, чтобы уметь заявить о проблеме и решить ее лицом к лицу. Моя мама — активистка. Она тихий и самый нежный человек, которого вы когда-либо встречали.Но даже с таким характером она проявляла эту силу. Это определенно повлияло на меня, и я пытался подражать этому в своей жизни. К сожалению, дискриминация по признаку пола или расовая дискриминация случается повсюду. Поэтому она научила меня проявлять инициативу и открыто говорить об этом, но при этом не слишком громко.

Наблюдать за моим отцом в детстве было интересно, потому что я сказал себе, что никогда не стану ученым; он всегда читает журналы и думает о науке, а что это за жизнь? Затем, в конце концов, я стал этим человеком.Боюсь, что я удерживаю своих дочерей от занятий наукой, потому что я делаю то же, что и мой отец. Наука — это сложно, но для меня это также самое захватывающее занятие. Я не могу представить себе другую работу, за которую мне платят за то, о чем я люблю думать.

Topol: Что ж, все, что происходило на пути, создало феномен. Вы великий педагог, а также великий ученый. Мы рады возможности навестить вас сегодня.

Verghese: Это было настоящим открытием для меня — ясный способ понять иммунную систему.Спасибо за то, что были с нами, и удачи в ваших исследованиях.

Topol: Я рекомендую всем, если они в Твиттере, подписаться на Акико Ивасаки (@VirusesImmunity) как на источник номер один действительно полезной информации. И если вы не в Твиттере, вам следует войти в него, потому что ей есть что предложить.

Акико, большое спасибо, что нашли время присоединиться к нам. Мы будем очень внимательно следить за вашей работой и вашей группой, потому что я знаю, что вы собираетесь распутать и деконструировать множество неизвестных, которые у нас есть сегодня.

Эрик Дж. Тополь, доктор медицины, входит в десятку самых цитируемых исследователей в медицине и часто пишет о технологиях в здравоохранении, в том числе в своей последней книге « Глубокая медицина: как искусственный интеллект может снова сделать здравоохранение человеком».

Абрахам Вергезе, доктор медицины, признанный критиками автор бестселлеров и врач с международной репутацией за то, что уделяет особое внимание лечению в эпоху, когда технологии часто подавляют человеческую сторону медицины.

Акико Ивасаки, доктор философии, иммунобиолог Йельского университета и Медицинского института Говарда Хьюза. Ее исследования сосредоточены на иммунитете против вирусов на поверхности слизистой оболочки. Она особенно заинтересована в информировании общественности об иммунной системе и о том, как она работает; она также выступает за повышение культуры науки и за студентов, изучающих естественные науки.

Следите за Medscape в Facebook, Twitter, Instagram и YouTube

Как дендритные клетки чувствуют вирусные инфекции и реагируют на них | Клиническая наука

Из-за высокой экспрессии рецептора CD4, CD4 ⁺ Т-клетки следует рассматривать как основные клетки, в которых происходит репликация ВИЧ.Однако частота этих клеток низкая в аногенитальных тканях, которые представляют собой один из основных путей проникновения ВИЧ, передаваемого половым путем. В этом отношении центральная роль DC в начальном заражении ВИЧ, последующей передаче и системном распространении подтверждается несколькими доказательствами. Выясняется, что некоторые субпопуляции DC, которые находятся в эпидермальном слое аногенитальных трактов, могут включать и поддерживать высокие уровни нагрузки ВИЧ, становясь эффективными векторами для распространения вируса [123–125].Если вначале эта роль отводилась исключительно LC [126–128], недавнее исследование ясно показало, что другая подгруппа DC, называемая эпидермальными DC CD11c ⁺ , которые обычно находятся в нижних эпидермальных слоях аногенитальных трактов, преимущественно вовлечены в половую жизнь. распространение передаваемого ВИЧ [129]. В отличие от LC, эпидермальные DC CD11c ⁺ не экспрессируют вирус-связывающий рецептор лангерин, но они обладают широким спектром других CLR, включая рецептор маннозы (MR, CD206) и более высокие количества CCR5, CD54 и CD80.Эти особенности делают эту подгруппу особенно склонной к взаимодействию с ВИЧ и способной эффективно переносить вирус на CD4 ⁺ Т-лимфоциты ( транс -инфекция) [129]. Более того, во время воспаления была описана дополнительная подгруппа DC, отличная от LC, которая заселяет эпидермис, таким образом потенциально играя решающую роль в распространении ВИЧ: воспалительные дендритные эпидермальные клетки (IDEC) [130]. Один из предложенных механизмов, лежащих в основе DC-зависимого распространения ВИЧ и транс-инфекции, опосредован CLR.Как и в случае IAV, CLR могут играть пагубную роль для хозяина также во время ВИЧ-инфекции. CLR, такие как лангерин (CD207), MR, DC-SIGN, SIGLEC-1 и иммунорецептор DC (DCIR), способны связывать несколько компонентов вирусной оболочки, включая гликопротеин gp120 [131–134] и ганглиозиды [135, 136]. В то время как это поверхностное взаимодействие позволяет DC воспринимать и включать ВИЧ, недостаточность надлежащей вирусной интернализации или отсутствие высвобождения новых вирионов может вызвать прогрессирующее накопление частиц ВИЧ на поверхности клетки [123].Это событие в сочетании с экспрессией молекул адгезии (CD54) и способностью мигрировать в LN, создавать кДК и особенно резидентные субпопуляции, способные переносить ВИЧ в Т-лимфоциты, превращая их в эффективные векторы доставки вирусов [124,137]. Этот механизм передачи сильно усиливается у пациентов, не способных спонтанно контролировать ВИЧ (прогрессоров), у которых измененный фенотип нескольких субпопуляций DC характеризуется сверхэкспрессией как CLR, так и молекул адгезии [138].Хотя также было показано, что фенотип pDC изменяется во время прогрессирования ВИЧ [139, 140], ВИЧ транс -инфекция, по-видимому, ограничивается резидентными и cDC субпопуляциями [141, 142]. Механизм переноса, описанный выше, однако, происходит независимо от продуктивной вирусной репликации внутри DC, а скорее основан на CLR-опосредованной доставке вируса. В связи с этим недавнее исследование показало, что более эффективный перенос в Т-лимфоциты может происходить, когда сами ДК подвержены продуктивной ВИЧ-инфекции ( цис- -инфекция) [129].DC cis -инфекция может также возникать как следствие начального CLR-опосредованного взаимодействия вирус-клетка в тех случаях, когда вовлеченная подгруппа DC обладает высокими уровнями корецепторов CCR5 или CD4, как в случае эпидермальных CD11c ⁺ DC. . Хотя некоторые подмножества DC, такие как CD141 ⁺ cDC, по своей природе являются более устойчивыми к проникновению ВИЧ [143], экспрессия вышеупомянутых рецепторов также делает подмножества cDC и pDC в принципе восприимчивыми к инфекции cis- .На этом этапе то, что делает DC особенно склонными к эффективной передаче ВИЧ другим клеткам, является их особая способность поддерживать высокий уровень вирусной нагрузки. В самом деле, несмотря на множество доступных PRR, обнаружению ВИЧ в DC может препятствовать присутствие множества внутренних молекул, сильно экспрессируемых в клонах миелоидных клеток. Некоторые субпопуляции DC, например, обладают высокими уровнями цитозольного домена SAM и белка, содержащего домен HD 1 (SAMHD1), что позволяет клеткам поддерживать вирусный геном на низком уровне за счет ингибирования процесса ретротранскрипции ВИЧ [144, 145]. .Это снижает накопление промежуточных продуктов вирусной ДНК, тем самым предотвращая их обнаружение и индукцию IFN-I, позволяя клетке лучше выдерживать высокие вирусные нагрузки [146]. Хотя этот механизм в принципе представляется полезным, он препятствует установлению устойчивого противовирусного иммунного ответа у хозяина и может превратить инфицированные DC в оптимальные векторы доставки ВИЧ. Следовательно, внутренние механизмы DC, которые нацелены на более поздние стадии репликации вируса, такие как процесс интеграции или высвобождение новых вирусных частиц, представляют собой более эффективную противовирусную стратегию.В самом деле, эти механизмы вызывают прогрессирующее накопление промежуточных продуктов ретротранскрипции, позволяя DC лучше обнаруживать вирусные PAMPs, чтобы эффективно осуществлять презентацию антигена [147]. Как упоминалось выше, у прогрессоров несколько субпопуляций DC избыточно экспрессируют многие поверхностные маркеры, включая CLRs, адгезионные и костимуляторные молекулы [148]. В большинстве случаев эти индуцированные ВИЧ изменения могут влиять на ДК, изменяя их анатомическое распределение или придавая им конститутивно активный фенотип. В частности, эти возмущения кажутся особенно актуальными в случае КПК.Например, было описано, что патогенез ВИЧ коррелирует с перераспределением циркулирующих pDC, которые покидают кровь, чтобы достичь LN и других областей [149]. Несмотря на это, похоже, что эта пониженная частота пДК в крови является признаком прогрессирования заболевания или хронической инфекции, а не событием первоначального противовирусного ответа. В соответствии с этой идеей недавнее исследование показывает, что на ранних стадиях ВИЧ-инфекции количество пДК временно увеличивается в крови до начала плазменной виремии [122].Хотя эти клетки демонстрируют активированный фенотип с сильной сигнатурой IFN-I, по сравнению со здоровыми пациентами или пациентами, контролирующими прогрессирование ВИЧ (контролеры), они оказываются менее чувствительными к ВИЧ или другим вирусным PAMP при стимуляции in vitro [150] . Более того, было замечено, что рефрактерное состояние pDC сохраняется и во время прогрессирования заболевания [151]. pDC от прогрессоров также показали длительную поверхностную экспозицию TNF-связанного лиганда, индуцирующего апоптоз (TRAIL) из-за измененного цитозольного транспорта молекулы.Отсутствие удаления поверхности TRAIL позволяет этому эффектору запускать гибель клеток в клетках, с которыми он контактирует, включая Т-клетки CD4 ⁺ , тем самым участвуя в прогрессирующем истощении этих клеток [139].

.

No related posts.